פיגום מרוכבים קולגן-צ'יטוסן טעון דוקסיציקלין לריפוי מואץ של פצעים סוכרתיים
Summary
פיגום DOX-CL המוכן סיפק את התנאים הקדים של רוטב DW אידיאלי בחוזק מכני, נקבוביות, ספיגת מים, שיעור השפלה, שחרור מתמשך, אנטי בקטריאלי, תאימות ביולוגית, תכונות אנטי דלקתיות, אשר נחשבים חיוניים להתאוששות של רקמה פגומה ב- DWs.
Abstract
סיבוך מרכזי אחד של סוכרת הוא פצעים סוכרתיים (DW). השלב הממושך של דלקת בסוכרת חוסם את השלבים הנוספים של פציעה המובילה לריפוי פצעים מאוחר. בחרנו דוקסיציקלין (DOX), כסם פוטנציאלי של בחירה, בשל תכונות אנטי בקטריאלי שלה יחד עם תכונות אנטי דלקתיות דיווח שלה. המחקר הנוכחי נועד לנסח פיגומים שאינם מקושרים קולגן-צ’יטוסן (NCL) וקישורים מקושרים (CL) של DOX ולהעריך את יכולת הריפוי שלהם בתנאי סוכרת. תוצאת האפיון של פיגומים מגלה כי פיגום DOX-CL מחזיק נקבוביות אידיאלית, שיעור נפיחות נמוך השפלה, ושחרור מתמשך של DOX לעומת פיגום DOX-NCL. מחקרי ההפריה החוץ גופית מגלים כי פיגום DOX-CL היה תואם ביולוגית וצמיחת תאים משופרת בהשוואה לפיגומי CL שטופלו וקבוצות בקרה. המחקרים האנטי-בקטריאליים הראו כי פיגום DOX-CL היה יעיל יותר מפיגומי CL נגד החיידקים הנפוצים ביותר שנמצאו ב- DW. באמצעות מודל DW סטרפטוזוטוצין ושומן גבוה דיאטה המושרה, שיעור מהיר יותר באופן משמעותי (p≤0.05) של התכווצות הפצע בקבוצת פיגומים DOX-CL נצפתה בהשוואה לאלה בפיגומים CL שטופלו וקבוצות בקרה. השימוש בפיגומים DOX-CL יכול להתברר כגישה מבטיחה לטיפול מקומי עבור DWs.
Introduction
סוכרת (DM) היא מצב שבו הכישלון של הגוף לספק אינסולין או להגיב לתוצאותיו בעיכול חריג של סוכרים פשוטים מביא לעלייה של גלוקוז בדם 1. ההסתבכות הרצונית והמרסקת ביותר של DM היא הפצע הסוכרתי (DW). בערך 25% מהחולים עם DM יש את ההזדמנות לבנות DW בחיים שלהם 1. הריפוי המופרע של DW מוכר לשלישייה של DM: אימונופתיה, ואסקולופתיה ונוירופתיה. בכל פעם DW נשאר מטופל, זה עלול לגרום להתפתחות נמק, ולכן מבקש את הסרת האיבר המודאג 2.
טיפולים רבים, כגון הנחיית המטופלים (לבדוק את הפצע מדי יום, לנקות את הפצע, להימנע מפעילויות שיוצרות לחץ על הפצע, ניטור גלוקוז תקופתי וכו ‘), שליטה על רמת הגלוקוז בדם שלהם, פירוק פצעים, העברת לחץ, הליך רפואי, טיפול בחמצן היפרברי וטיפולים מתקדמים הם בפועל 3,4. רוב התרופות הללו אינן מתייחסות לכל התנאים הקדם החיוניים לטיפול DW לאור התנאים הפתופיזיולוגיים הרב-גורמיים והוצאות בלתי צפויות הקשורות לתרופות אלה 5. למרות פתוגנזה DW הוא רב-גורמי, דלקת מתמשכת עם ניהול רקמות בלתי הולם הוא הצהיר להיות הסיבה בפועל לריפוי מאוחר DWs 5,6.
רמות מוגברות של מתווכים דלקתיים ופרו דלקתיים ב- DW גורמות לגורמי גדילה מופחתים האחראים לריפוי פצעים מאוחר 2,6. היווצרות מטריצה חוץ-תאית לא נכונה (ECM) ב- DWs מוסמכת לרמות גבוהות יותר של מטריצה metalloproteinases (MMPs) אחראי על השפלה מהירה של ECM שנוצר. ב MMPs, MMP-9 מדווח כמתווך גדול אחראי על דלקת ממושכת השפלה ECM מהירה 7. הואציין כי טיפול מקומי עם תרופה אנטי דלקתית שמפחית את רמות גבוהות של MMP-9 מחדש מקים הומאוסטזיס עורי, סידור מסגרת ומבקש ריפוי טוב יותר של DWs 8,9.
Doxycycline (DOX), מעכב MMP-9, נבחר לדכא את הרמות הגבוהות של MMP-9, מתווך דלקתי גדול אחראי על דלקת מתמשכת ב- DWs 10,11,12. בנוסף, DOX מחזיק נוגד חמצון (לייצר הידרוקסי חינם פנוקסי רדיקלים מסוגל לקשור עם מינים חמצן תגובתי) 13 ואנטי אפופטוטי (לעכב ביטוי קפס וייצוב מיטוכונדריאלי) 14 פעילויות החיוניות לטיפול DW. נבחר הסדר המסגרות המכילות DOX, קולגן (COL) וצ’יטוסן (CS). הבחירה של COL תלויה באופן שבו הוא מסייע במתן המסגרת הדרושה האחראית על כוח מכני והתחדשות רקמות 15. מצד שני, CS הוא הומולוגי מבחינה מבנית כדי glycosaminoglycan, הקשורים עם מספר שלבים ריפוי פצע. כמו כן, הוא דיווח כי CS מחזיק נכס אנטי בקטריאל משמעותי 15. לפיכך, פיגום COL / CS של DOX מנוסח כדי לדכא את הדלקת הממושכת, ואחריו תמיכה היווצרות המטריצה לריפוי פצע מוצלח בתנאי DM.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה העיקרית של מחקר זה הייתה לקבוע את ההשפעה של פיגום COL-CS טעון DOX על ריפוי DW בחולדות. CL ו- NCL הוכנו והוערכה במונחים של מורפולוגיה, מדד נפיחות, קינטיקה שחרור במבחנה, תאימות ביולוגית.
אפיון פיגום NCL ו- CL טעון של DOX
הפיגומים המוכנים נמצאו נקבוביים עם נקבוביות מחוברות. נ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד”ר אשיש ד וודהואני. (עוזר פרופסור וראש המחלקה לביוטכנולוגיה פרמצבטית, המכללה לרוקחות JSS, אוטי, הודו) לסיוע במחקרי כדאיות תאי במבחנה.
המחברים רוצים להודות למחלקה למדע וטכנולוגיה – קרן לשיפור תשתיות המדע והטכנולוגיה באוניברסיטאות ובמוסדות להשכלה גבוהה (DST-FIST), ניו דלהי, על תמיכתם במחלקה שלנו.
המחברים גם אוהבים להודות למר סנג’ו. ס’ ומר סרירם. תלמידי נרוקולה מ. פארם על תמיכתם בצילומי הווידאו.
מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה להשכלה גבוהה JSS (JSSAHER).
Materials
| 1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) | Merck Millipore, Mumbai, India | E7750 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Merck Millipore, Mumbai, India | 137074 | |
| 3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) | Thermo Fisher, Mumbai, India | M6494 | |
| Deep freezer verticle | Labline Instruments, Kochi, India | ||
| Dialysis sack | Merck Millipore, Mumbai, India | D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da | |
| Doxycycline | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | D9891 | |
| Elisa kit | R&D Systems | RMP900 | |
| Escherichia coli (E. coli) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2567 | |
| Ethanol | Merck Millipore, Mumbai, India | 100983 | |
| Lyophilizer-SZ042 | Sub-Zero lab instruments, Chennai, India | ||
| Mechanical Stirrer-RQ-122/D | Remi laboratory instruments, Mumbai, India | ||
| Medium molecular weight Chitosan | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 18824 | |
| Microtome-RM2135 | Leica, U.K | ||
| Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1) | National Centre for Cell Sciences, Pune, India | ||
| Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro | Tecan Instruments, Switzerland | ||
| N-hydroxy succinimide (NHS) | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | 130672 | |
| Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 2036 | |
| Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800 | Hitachi, India | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) pellets | Qualigen fine chemicals, Mumbai, India | Q27815 | |
| Staphylococcus aureus (S. aureus) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5022 | |
| Staphylococcus epidermis (S. epidermis) | National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India | NCIM 5270 | |
| Streptozotocin (STZ) | Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India | 14653 | |
| Type-1 rat Collagen | Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India | C7661 | |
| Ultraviolet–visible spectroscopy-1700 | Shimadzu |
Riferimenti
- . IDF Diabetes Atlas, 9th edn Available from: https://www.diabetesatlas.org (2019)
- Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. The Lancet. 366 (9498), 1736-1743 (2005).
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the treatment of chronic wounds. Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).
- Alexiadou, K., Doupis, J. Management of diabetic foot ulcers. Diabetes Therapy. 3 (1), 1-15 (2012).
- Karri, V. V. S. R., et al. Current and emerging therapies in the management of diabetic foot ulcers. Current Medical Research and Opinion. 32 (3), 519-542 (2016).
- Sanapalli, B. K., et al. Human beta defensins may be a multifactorial modulator in the management of diabetic wound. Wound Repair and Regeneration. 28 (3), 416-421 (2020).
- Caley, M. P., Martins, V. L., O’Toole, E. A. Metalloproteinases and wound healing. Advances in Wound Care. 4 (4), 225-234 (2015).
- Reiss, M. J., et al. Matrix metalloproteinase-9 delays wound healing in a murine wound model. Surgery. 147 (2), 295-302 (2010).
- Gill, S. E., Parks, W. C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (6-7), 1334-1347 (2008).
- Stechmiller, J., Cowan, L., Schultz, G. The role of doxycycline as a matrix metalloproteinase inhibitor for the treatment of chronic wounds. Biological Research for Nursing. 11 (4), 336-344 (2010).
- Griffin, M. O., Fricovsky, E., Ceballos, G., Villarreal, F. Tetracyclines: a pleitropic family of compounds with promising therapeutic properties. Review of the literature. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (3), 539-548 (2010).
- Burns, F., Stack, M., Gray, R., Paterson, C. Inhibition of purified collagenase from alkali-burned rabbit corneas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (7), 1569-1575 (1989).
- Kraus, R. L., et al. Antioxidant properties of minocycline: neuroprotection in an oxidative stress assay and direct radical-scavenging activity. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 819-827 (2005).
- Yrjänheikki, J., Keinänen, R., Pellikka, M., Hökfelt, T., Koistinaho, J. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (26), 15769-15774 (1998).
- Moura, L. I., Dias, A. M., Carvalho, E., de Sousa, H. C. Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment-a review. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7093-7114 (2013).
- Natarajan, J., et al. Nanostructured Lipid Carriers of Pioglitazone Loaded Collagen/Chitosan Composite Scaffold for Diabetic Wound Healing. Advances in Wound Care. 8 (10), 499-513 (2019).
- Karri, V. V. S. R., et al. Curcumin loaded chitosan nanoparticles impregnated into collagen-alginate scaffolds for diabetic wound healing. International Journal Of Biological Macromolecules. 93, 1519-1529 (2016).
- Hsieh, W. -. C., Chang, C. -. P., Lin, S. -. M. Morphology and characterization of 3D micro-porous structured chitosan scaffolds for tissue engineering. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 57 (2), 250-255 (2007).
- Xie, Y., Chen, J., Xiao, A., Liu, L. Antibacterial activity of polyphenols: structure-activity relationship and influence of hyperglycemic condition. Molecules. 22 (1913), 1-11 (2017).
- Geerlings, S. E., Brouwer, E. C., Gaastra, W., Verhoef, J., Hoepelman, A. I. Effect of glucose and pH on uropathogenic and non-uropathogenic Escherichia coli: studies with urine from diabetic and non-diabetic individuals. Journal of Medical Microbiology. 48 (6), 535-539 (1999).
- Eloff, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. 64 (8), 711-713 (1998).
- Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clinical Biochemistry. 29 (3), 225-229 (1996).
- Charulatha, V., Rajaram, A. Influence of different crosslinking treatments on the physical properties of collagen membranes. Biomaterials. 24 (5), 759-767 (2003).
- Rehakova, M., Bakoš, D., Vizarova, K., Soldán, M., Jurícková, M. Properties of collagen and hyaluronic acid composite materials and their modification by chemical crosslinking. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials. 30 (3), 369-372 (1996).
- Chang, M. -. Y., et al. Doxycycline enhances survival and self-renewal of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 353-364 (2014).
- Dovi, J. V., He, L. K., DiPietro, L. A. Accelerated wound closure in neutrophil-depleted mice. Journal of Leukocyte Biology. 73 (4), 448-455 (2003).
- Lindeman, J. H., Abdul-Hussien, H., van Bockel, J. H., Wolterbeek, R., Kleemann, R. Clinical Perspective. Circulation. 119 (16), 2209-2216 (2009).
- Zhang, C., Gong, W., Liu, H., Guo, Z., Ge, S. Inhibition of matrix metalloproteinase-9 with low-dose doxycycline reduces acute lung injury induced by cardiopulmonary bypass. International Journal Of Clinical And Experimental Medicine. 7 (12), 4975-4982 (2014).
