समय-हल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए फास्ट ग्रिड तैयारी
Summary
यहां, हम तेजी से ग्रिड बनाने दोनों के लिए एक रैपिड ग्रिड बनाने वाले डिवाइस के उपयोग के लिए और समय-हल किए गए प्रयोगों का संचालन करने के लिए तेजी से मिश्रण और ठंड के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) का क्षेत्र तेजी से नए हार्डवेयर और प्रसंस्करण एल्गोरिदम के साथ विकसित हो रहा है, जो उच्च संकल्प संरचनाओं और अधिक चुनौतीपूर्ण प्रणालियों के बारे में जानकारी का उत्पादन कर रहा है। क्रायो-ईएम के लिए नमूना तैयारी पारंपरिक ब्लॉटिंग सिस्टम को अधिस्थान करने के लिए विकसित किए जा रहे नए दृष्टिकोणों के साथ एक समान क्रांति के दौर से गुजर रही है। इनमें पीजो-इलेक्ट्रिक डिस्पेंसर का उपयोग, पिन प्रिंटिंग और प्रत्यक्ष छिड़काव शामिल हैं। इन घटनाओं के परिणामस्वरूप, ग्रिड तैयार करने की गति सेकंड से मिलीसेकंड तक जा रही है, विशेष रूप से समय-हल किए गए क्रायो-ईएम के क्षेत्र में नए अवसर प्रदान करती है, जहां प्रोटीन और सब्सट्रेट्स को डुबकी ठंड से पहले तेजी से मिलाया जा सकता है, अल्पकालिक मध्यवर्ती राज्यों को फंसाने। यहां हम विस्तार से, हमारे इन-हाउस समय-हल ईएम डिवाइस पर ग्रिड बनाने के लिए मानक फास्ट ग्रिड तैयारी और समय-हल किए गए प्रयोगों के लिए भी एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल के लिए 4 ग्रिड तैयार करने के लिए ≥ 2 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता पर न्यूनतम लगभग 50 माइक्रोन नमूना की आवश्यकता होती है। नमूना आवेदन और ठंड के बीच देरी के रूप में 10 एमएस के रूप में कम हो सकता है । एक सीमा तेज गति से बर्फ की मोटाई में वृद्धि हुई है और ब्लॉटिंग विधि की तुलना में । हमें उम्मीद है कि यह प्रोटोकॉल दूसरों को अपने ग्रिड बनाने वाले उपकरणों और समय-हल किए गए प्रयोगों को डिजाइन करने में रुचि रखने वालों को डिजाइन करने में सहायता करेगा।
Introduction
पृष्ठभूमि
क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) में हाल की घटनाओं ने उच्च संकल्प पर तेजी से जटिल प्रणालियों के संरचनात्मक अध्ययन को सक्षम किया है। कुछ अपवादों के साथ, इस तरह के अध्ययन संतुलन1 या अपेक्षाकृत धीमी प्रतिक्रियाओं पर जैविक मैक्रोमॉलिक्यूल्स तक सीमित रहे हैं2। वीवो में कई प्रक्रियाएं तेजी से टाइमस्केल (मिलीसेकंड) पर होती हैं और इन टाइमस्केल 3 पर समय-हल होने वाले क्रायो-ईएम (टीआरईएम) में रुचि बढ़ रही है। हालांकि, ब्लॉटिंग विधि द्वारा पारंपरिक क्रायो-ईएम नमूना तैयार करना मिलीसेकंड टीआरईएम के लिए बहुत धीमा है।
ब्लॉटिंग विधि में खराब समय संकल्प के अलावा अन्य सीमाएं हैं। प्रोटीन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स4ग्रिड पर डेनैचेशन या पसंदीदा अभिविन्यास से पीड़ित हो सकते हैं। नमूना तैयारी के दौरान हवा-पानी के इंटरफ़ेस के संपर्क में आने वाले समय को कम करने के लिए पसंदीदा अभिविन्यास और प्रोटीन डेनैचुरेशन5,6को कम करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, फास्ट ग्रिड तैयारी न केवल मिलीसेकंड टीआरईएम को सक्षम बनाती है बल्कि ग्रिड की गुणवत्ता में भी सुधार कर सकती है।
वर्तमान में, स्वचालित ग्रिड तैयारी के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोण हैं। पहला दृष्टिकोण एक पिन या केशिका का उपयोग करता है जो थोड़ी मात्रा में नमूना रखता है। तरल और ग्रिड सतह के बीच संपर्क स्थापित करने के बाद, नमूना ग्रिड7,8पर ‘लिखा’ है। नमूना आवेदन प्रक्रिया अपेक्षाकृत धीमी है और इसमें कुछ सेकंड लगते हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक पीजो डिस्पेंसर और सेल्फ-बाती ग्रिड9द्वारा नियंत्रित बूंद पीढ़ी का उपयोग करता है। यह तेजी से समय फ्रीज करने के लिए बांटना की अनुमति देता है, लेकिन अभी भी बूंद और बाती गति से सीमित है (वर्तमान में ५४ एमएस तक पहुंचने) । अब तक का सबसे तेज़ दृष्टिकोण प्रत्यक्ष स्प्रे दृष्टिकोण है, जिसमें नमूना स्प्रे नोजल और छोटे (~ 10 – 20 माइक्रोन) और क्रायो-ईएम ग्रिड के संपर्क में फैलने वाली तेज (5 मीटर/>) बूंदों में परमाणु है। नमूना स्प्रे विभिन्न तरीकों जैसे एयरब्लास्ट एटमाइजर्स, सतह ध्वनिक तरंगों या अल्ट्रासोनिक ह्यूमिडिफायर्स10, 11,12,13जैसे विभिन्न तरीकों से उत्पन्न किया जासकताहै। हमारे अनुभव में, प्रत्यक्ष छिड़काव दृष्टिकोण के साथ बर्फ की मोटाई अधिक है, लेकिन प्रत्यक्ष छिड़काव 10 एमएस < के समय फ्रीज करने के लिए बांटना सक्षम बनाता है ।
यह प्रोटोकॉल चरण-दर-कदम बताता है कि माइक्रोफ्लुइडिक स्प्रे नोजल से लैस एक समय-हल ईएम डिवाइस (टेड) का उपयोग तेजी से टाइमस्केल14, 15पर ग्रिड तैयार करने के लिए कैसे किया जा सकता है। डिवाइस नमूना आवेदन और ठंड के बीच 6 एमएस की एक ंयूनतम देरी समय के साथ ग्रिड तैयार करने के लिए और तेजी से मिश्रण और दो नमूनों को फ्रीज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । टेड का डिजाइन पिछले संस्करण16 पर आधारित है और अन्य स्प्रे-आधारित समय-हल क्रायो-ईएम उपकरणों17के समान है।
सबसे पहले, टेड सेटअप के चार मुख्य भागों का वर्णन किया गया है। टेड का मूल तरल हैंडलिंग इकाई है, जो नमूना आकांक्षा और वितरण के लिए जिम्मेदार है। एक वायवीय प्लंजर स्प्रे के माध्यम से ग्रिड को तरल इथेन में ले जाता है। स्प्रे का उत्पादन माइक्रोफ्लुइडिक स्प्रे नोजल के साथ हासिल किया जाता है और ठंड एक तरल इथेन कंटेनर में की जाती है, जिसे संक्षेप में वर्णित किया जाता है। अंत में, ग्रिड पर्यावरण, विशेष रूप से आर्द्रता को नियंत्रित करने के लिए अतिरिक्त सुविधाओं पर प्रकाश डाला गया है। इसके बाद डिवाइस के संचालन के लिए और टीआरईएम प्रयोगों के संचालन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल हैं। प्रतिनिधि परिणाम तेजी से ग्रिड की तैयारी और एक सरल TrEM प्रयोग के लिए दिए जाते हैं।
प्रायोगिक सेटअप
तरल हैंडलिंग इकाई
टेड का लिक्विड हैंडलिंग सिस्टम तीन सिरिंज ड्राइव पंप (‘पंप 1 – 3’) द्वारा बनाया गया है, प्रत्येक रोटरी वाल्व(चित्रा 1)से लैस है। एक बिजली की आपूर्ति 24 वी डीसी के साथ पंप 1 – 3 प्रदान करता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ संचार (विजुअल बेसिक और सी ++) में लिखा गया है, जो 1 पंप करने के लिए RS232 इंटरफेस के माध्यम से है। आदेश 1 पंप से पंप 2-3 के लिए धारावाहिक I/O विस्तार बंदरगाहों के माध्यम से वितरित कर रहे हैं । पंप 1-3 ग्लास सीरिंज से लैस हैं (‘सीरिंज 1-3’, हम यहां 250 माइक्रोल/जीरो डेड वॉल्यूम सीरिंज का इस्तेमाल करते हैं)। प्रत्येक वाल्व में दो स्थितियां होती हैं, ‘लोड’ और ‘डिस्पेंस’। ‘लोड’ स्थिति का उपयोग सिरिंज में नमूना को एस्पिरेट करने के लिए किया जाता है। एक छोटा टुकड़ा (~ 3-4 सेमी) 1/16 के “O.D., 0.01 ′ ‘ I.D. FEP टयूबिंग ETFE के माध्यम से जुड़ा हुआ है/ ट्यूबिंग का यह छोटा टुकड़ा नमूना जलाशय (आमतौर पर 1.5 एमएल या 0.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब) में पहुंचता है। ‘डिस्पेंस’ स्थिति स्प्रे नोजल की ओर जाता है। ‘डिस्पेंस’ आउटलेट और स्प्रे नोजल के बीच कनेक्शन पीई ट्यूबिंग (~ 20-30 सेमी लंबाई, 0.043” O.D., 0.015 “I.D.) द्वारा किया जाता है, जिसमें आस्तीन ट्यूबिंग (~ 0.5 सेमी) और ETFE/ETFE फ्लैंजलेस फिटिंग का एक छोटा टुकड़ा होता है।
वायवीय प्लंजर
टेड ग्रिड में तेजी लाने और नमूना स्प्रे के माध्यम से तरल इथेन कंटेनर में इसे स्थानांतरित करने के लिए एक वायवीय प्लंजर का उपयोग करता है। नकारात्मक दबाव चिमटी ग्रिड पकड़, एक घर में खराब धारक जो एक दोहरी रॉड वायवीय सिलेंडर(चित्रा 2A)के लिए मुहिम शुरू की है ।
दबाव एक बड़े नाइट्रोजन गैस सिलेंडर (आकार डब्ल्यू) से आपूर्ति की जाती है, जो एक बहुमंच नियामक (0 – 10 बार, ‘मुख्य दबाव’ से लैस है। लचीला प्रबलित पीवीसी ट्यूबिंग (12 मिमी O.D.) नियामक को 12-पोर्ट कई गुना से जोड़ता है जहां दबाव नाइट्रोजन नोजल और वायवीय प्लंजर को दिया जाता है। नोजल के माध्यम से गैस का प्रवाह स्थिर होता है, सीधे नाइट्रोजन सिलेंडर (मुख्य दबाव) पर विनियमित होता है। नोजल का कनेक्शन पीयू ट्यूबिंग (4 मिमी O.D., 2.5 मिमी I.D.), पीई ट्यूबिंग का एक छोटा टुकड़ा (~ 8 सेमी लंबाई, 0.043″ O.D., 0.015 “I.D.) और उपयुक्त कनेक्टर के साथ बनाया गया है। वायवीय प्लंजर पर दबाव एक सोनालिका वाल्व के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। पीयू ट्यूबिंग (4 मिमी O.D., 2.5 मिमी I.D.) एक नियामक और वायवीय प्लंजर के साथ सोनालिका वाल्व को जोड़ता है, ताकि कम डुबकी दबाव (≤ मुख्य दबाव) की अनुमति दी जा सके। सोनालिका वाल्व कंप्यूटर नियंत्रित है। चित्रा 2बीमें सेटअप का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन दिया गया है ।
ध्यान दें कि इस सेटअप के साथ डुबकी दबाव हमेशा स्प्रे गैस दबाव (मुख्य दबाव) से बराबर या छोटा होता है। हालांकि, कम स्प्रे गैस दबाव पर उच्च डुबकी गति की अनुमति देने के लिए स्प्रे नोजल के एक दूसरे नियामक अपस्ट्रीम को शामिल करके सेटअप को आसानी से बदला जा सकता है। उच्च दबाव (>> 2 बार) पीडीएमएस स्प्रे नोजल को नुकसान पहुंचा सकता है।
सावधानी: यह एक दबाव प्रणाली है और ‘मुख्य दबाव’ हमेशा 7 बार < होना चाहिए।
0.5 और 2 बार के बीच दबाव आमतौर पर वायवीय प्लंजर के लिए उपयोग किया जाता है और दबाव और गति (स्प्रे की ऊर्ध्वाधर स्थिति पर) के बीच लगभग रैखिक संबंध दिखाता है। डुबकी की गति को ऑसिलोस्कोप के साथ मापा जाता है, जो स्लाइड शक्तिशाली (10 kΩ) के अनुरूप और 2 kΩ प्रतिरोधक(चित्रा 2C)के समानांतर जुड़ा हुआ है। एक बिजली की आपूर्ति 9 वी डीसी के साथ शक्तिशाली आइटम प्रदान करता है। जबकि अनुमानित डुबकी गति डुबकी दबाव स्थापित करके प्रयोग से पहले सेट किया जाता है, शक्तिशालीमीटर प्रयोग के बाद गति का एक सटीक readout देता है ।
स्प्रे नोजल और तरल इथेन कंटेनर
स्प्रे आधारित नमूना वितरण के लिए गैस-गतिशील वर्चुअल नोजल के निर्माण और संचालन को विस्तार से15अन्य जगहों पर वर्णित किया गया है। जैसा कि ऊपर वर्णित है, वाल्व 1-3 के ‘डिस्पेंस’ आउटलेट नोजल(चित्रा 3 ए)के तरल इनलेट्स से जुड़े होते हैं। दबाव स्प्रे गैस नोजल के गैस इनलेट से जुड़ा होता है। पीडीएमएस स्प्रे नोजल में इनलेट्स ऐसे हैं कि 0.043 “डी पीई ट्यूबिंग का उपयोग फिटिंग की आवश्यकता के बिना सीधे किया जा सकता है। हमारे नोजल डिजाइन में दो नमूनों के मिश्रण के लिए ‘जेट-इन-जेट’ ज्यामिति शामिल है, जो रेफरी18में वर्णित डिवाइस के समान है। चित्र 3बीमें डिजाइन की एक योजनाबद्ध दिखाया गया है, एक नोजल की एक सूक्ष्म छवि चित्र 3 सीमें दिखाई गई है। माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के लेआउट में दो नमूनों को मिलाने के लिए तीन सीरिंज के इस्तेमाल की जरूरत होती है । स्प्रे नोजल आमतौर पर ग्रिड (नमूना आवेदन के दौरान) से 1-1.5 सेमी दूरी पर तैनात है।
हम एक क्रायोजेन के रूप में तरल इथेन का उपयोग करते हैं, एक तरल इथेन/नाइट्रोजन कंटेनर में के रूप में मानक ब्लॉटिंग विधि के लिए इस्तेमाल किया । तरल इथेन कप की ऊर्ध्वाधर स्थिति प्रयोगशाला उठाने के मंच के साथ हासिल की जाती है।
स्प्रे और ग्रिड पर्यावरण का नियंत्रण
प्लंजर और स्प्रे नोजल एक कस्टम निर्मित पीएमएमए (ऐक्रेलिक ग्लास) बॉक्स के भीतर एक डबल डोर(चित्रा 4A)के साथ निहित हैं। बॉक्स के अंदर उच्च सापेक्ष आर्द्रता टेड(चित्रा 4B)के पीछे एक वायु-आर्द्रीकरण प्रणाली द्वारा प्राप्त की जाती है। हवा एक पंप द्वारा आपूर्ति की है और एक पहले 10 में खिलाया “कनस्तर (आम तौर पर सिंक पानी शुद्धिकरण के तहत के लिए इस्तेमाल किया) । कनस्तर पानी के एक कम (~ 5-10 सेमी) स्तर से भरा हुआ है और यह भी एक ह्यूमिडिफायर इकाई घरों। ह्यूमिडिफायर को मेन्स पावर को डिजिटल आर्द्रता/तापमान नियंत्रक और एक्रेलिक ग्लास बॉक्स के अंदर स्थित आर्द्रता/तापमान सेंसर द्वारा नियंत्रित किया जाता है । नियंत्रक को पंप बंद करने के लिए सेट है जब सापेक्ष आर्द्रता ९०% ≥ तक पहुंचता है । पहले कनस्तर से आर्द्रीकृत हवा को एक विसारक के माध्यम से पंप किया जाता है, जो दूसरे 10 “कनस्तर में पानी में डूबे होते हैं और फिर ऐक्रेलिक ग्लास बॉक्स में प्रवेश करते हैं।
सावधानी: क्योंकि नमूना स्प्रे नोजल में एयरोसोलाइज्ड है, खतरनाक जैविक या रासायनिक नमूना नमूने के रूप में उपयुक्त नहीं हैं।
रन अनुक्रम
नियंत्रण सॉफ्टवेयर में रन स्क्रिप्ट बटन रन अनुक्रम शुरू करता है। आदेशों के इस अनुक्रम को स्क्रिप्ट फ़ाइल में पूर्व-परिभाषित किया जा सकता है और सॉफ्टवेयर के माध्यम से बदल दिया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण चर यहां समझाया गया है:
स्प्रे गति: स्प्रे की गति सिरिंज पंप द्वारा उपयोग किए जाने वाले तरल प्रवाह को निर्धारित करती है। फ्लिकेट की गणना इस प्रकार की जा सकती है: यहां उपयोग की जाने वाली सिरिंज पंप मोटर्स का एक निश्चित चरण आकार होता है। पंप की पूरी रेंज 48,000 चरणों में विभाजित है। दूसरा महत्वपूर्ण कारक सिरिंज की मात्रा है। हम आम तौर पर 250 माइक्रोन सीरिंज का उपयोग करते हैं। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्प्रे की गति चरणों/सेकंड की संख्या के रूप में निर्धारित की जाती है । 1000 चरणों/सेकंड की एक स्प्रे गति से मेल खाती है:
स्प्रे की मात्रा: स्प्रे की मात्रा कुल मात्रा को छिड़काव करने के लिए निर्धारित करती है। इस प्रकार, यह स्प्रे की अवधि भी निर्धारित करता है। नियंत्रण सॉफ्टवेयर में स्प्रे की मात्रा कई चरणों के रूप में सेट की जाती है। 1000 चरणों/सेकंड की स्प्रे गति पर 2000 चरणों की स्प्रे मात्रा, 2 एस की स्प्रे अवधि और 10.4 माइक्रोन की कुल मात्रा की ओर जाता है।
प्री-स्प्रे समय: यह चर स्प्रे की शुरुआत और डुबकी के बीच के समय को परिभाषित करता है। यह देरी समय इस तरह का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्प्रे ग्रिड जल्दी से आगे बढ़नेवाला से पहले स्थिर करने के लिए पर्याप्त समय है । आमतौर पर, ग्रिड के गिरने से पहले स्थिर होने के लिए स्प्रे 1.5 – 4 एस दिया जाता है। जब तक ग्रिड के माध्यम से स्थानांतरित नहीं हो जाता तब तक स्प्रे बनाए रखा जाता है। आमतौर पर, ग्रिड के गिर जाने के बाद तरल प्रवाह (और इसलिए स्प्रे) को 0.5 से 1 एस बंद कर दिया जाता है। 1000 चरणों/एस की स्प्रे गति और 2000 चरणों की स्प्रे मात्रा का उपयोग करके, उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट प्री-स्प्रे समय 1.5 एस है।
आदेशों का एक अनुकरणीय अनुक्रम चित्रा 5 एमें दिखाया गया है , समय के साथ ग्रिड की स्थिति चित्र 5बीमें दिखाई जाती है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में प्रोटोकॉल का उपयोग सीधे छिड़काव और टीआरईएम प्रयोगों द्वारा तेजी से ग्रिड तैयार करने के लिए किया जा सकता है। फास्ट ग्रिड तैयारी का उपयोग वायु जल इंटरफेस5के साथ कणों की बातचीत को कम क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मौली एस.C Gravett सहायक चर्चा और क्रायो-EM डेटा संग्रह के साथ मदद के लिए ABSL सुविधा कर्मचारियों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । डेविड पी Klebl लीड्स विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित Astbury केंद्र में वेलकम ट्रस्ट 4 साल के पीएचडी कार्यक्रम पर पीएचडी के छात्र हैं । FEI टाइटन Krios माइक्रोस्कोप लीड्स विश्वविद्यालय (UoL ABSL पुरस्कार) और वेलकम ट्रस्ट (108466/Z/15/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया । इस काम को स्टीफन पी Muench (BB/P026397/1) के लिए एक BBSRC अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AMR21-236078) और हावर्ड डी व्हाइट और Vitold Galkin से अमेरिका के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (171261) से हावर्ड डी व्हाइट को अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित ।
Materials
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10×70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
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