Preparazione rapida della griglia per la microscopia crioeletletnica risolta nel tempo
Summary
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l’uso di un dispositivo di creazione rapida della griglia sia per la creazione rapida della griglia che per la miscelazione e il congelamento rapidi per condurre esperimenti risolti nel tempo.
Abstract
Il campo della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) si sta rapidamente sviluppando con nuovi hardware e algoritmi di elaborazione, producendo strutture a risoluzione più elevata e informazioni su sistemi più impegnativi. La preparazione dei campioni per la crio-EM sta subendo una rivoluzione simile con nuovi approcci in fase di sviluppo per sostituire i tradizionali sistemi di blotting. Questi includono l’uso di distributori piezoelettrici, la stampa a spillo e la spruzzatura diretta. Come risultato di questi sviluppi, la velocità di preparazione della griglia sta passando da secondi a millisecondi, offrendo nuove opportunità, specialmente nel campo della crio-EM risolta nel tempo in cui proteine e substrati possono essere rapidamente miscelati prima del congelamento a immersione, intrappolando stati intermedi di breve durata. Qui descriviamo, in dettaglio, un protocollo standard per la realizzazione di griglie sul nostro dispositivo EM interno con risoluzione temporale sia per la preparazione della griglia veloce standard che per gli esperimenti risolti nel tempo. Il protocollo richiede un minimo di circa 50 μL di campione a concentrazioni di ≥ 2 mg/mL per la preparazione di 4 griglie. Il ritardo tra l’applicazione del campione e il congelamento può essere di appena 10 ms. Una limitazione è l’aumento dello spessore del ghiaccio a velocità più elevate e rispetto al metodo di blotting. Speriamo che questo protocollo aiuti gli altri a progettare i propri dispositivi per la creazione di griglie e coloro che sono interessati a progettare esperimenti risolti nel tempo.
Introduction
Sfondo
I recenti sviluppi della microscopia crioeletletnica (cryo-EM) hanno permesso studi strutturali di sistemi sempre più complessi ad alta risoluzione. Con poche eccezioni, tali studi sono stati limitati a macromolecole biologiche all’equilibrio1 o reazioni relativamente lente2. Molti processi in vivo avvengono su una scala temporale più veloce (millisecondi) e c’è un crescente interesse per la crio-EM risolta nel tempo (TrEM) su queste scale temporali3. Tuttavia, la preparazione convenzionale del campione crio-EM con il metodo di blotting è troppo lenta per il millisecondo TrEM.
Il metodo di blotting ha altre limitazioni oltre alla scarsa risoluzione temporale. Le proteine e i complessi proteici possono soffrire di denaturazione o orientamento preferito sulle griglie4. La riduzione del tempo di esposizione all’interfaccia aria-acqua durante la preparazione del campione ha dimostrato di mitigare l’orientamento preferito e la denaturazione delle proteine5,6. Pertanto, la preparazione rapida della griglia non solo consente un trEM al millisecondo, ma può anche migliorare la qualità della griglia.
Attualmente, ci sono tre diversi approcci alla preparazione automatizzata della rete. Il primo approccio utilizza un perno o capillare che contiene una piccola quantità di campione. Dopo aver stabilito il contatto tra il liquido e la superficie della griglia, il campione viene “scritto” sulla griglia7,8. Il processo di applicazione di esempio è relativamente lento e richiede alcuni secondi. Un approccio alternativo utilizza la generazione controllata di goccioline da un distributore piezoelettrico e griglie autoaspiranti9. Ciò consente tempi di erogazione più rapidi per congelare, ma è ancora limitato dalla velocità delle goccioline e dell’assorbimento (attualmente raggiunge i 54 ms). L’approccio più veloce finora è l’approccio a spruzzo diretto, in cui il campione viene atomizzato in un ugello spray e le goccioline piccole (~ 10 – 20 μm) e veloci (> 5 m / s) si diffondono a contatto con la griglia crio-EM. Lo spray campione può essere generato attraverso diversi modi come atomizzatori di sabbiatura ad aria, onde acustiche di superficie o umidificatori ad ultrasuoni10,11,12,13. Nella nostra esperienza, lo spessore del ghiaccio con l’approccio a spruzzo diretto è maggiore, ma la spruzzatura diretta consente di congelare i tempi di erogazione < 10 ms.
Questo protocollo descrive passo dopo passo come un dispositivo EM a risoluzione temporale (TED) dotato di un ugello a spruzzo microfluidico può essere utilizzato per preparare le griglie su una scala temporale rapida14,15. Il dispositivo è stato utilizzato per preparare griglie con un tempo di ritardo minimo di 6 ms tra l’applicazione del campione e il congelamento e per miscelare e congelare rapidamente due campioni. Il design del TED si basa su una versione precedente16 ed è simile ad altri dispositivi cryo-EM risolti nel tempo basati su spray17.
Innanzitutto, vengono descritte le quattro parti principali della configurazione TED. Il cuore del TED è l’unità di gestione dei liquidi, che è responsabile dell’aspirazione e dell’erogazione dei campioni. Uno stantuffo pneumatico sposta la griglia attraverso lo spruzzo nell’etano liquido. La generazione dello spray si ottiene con ugelli di spruzzatura microfluidici e il congelamento viene effettuato in un contenitore di etano liquido, che viene descritto brevemente. Infine, vengono evidenziate le funzionalità aggiuntive per controllare l’ambiente della griglia, in particolare l’umidità. Questo è seguito da protocolli dettagliati per il funzionamento del dispositivo e per la conduzione di esperimenti TrEM. Vengono forniti risultati rappresentativi per una rapida preparazione della griglia e un semplice esperimento TrEM.
Configurazione sperimentale
L’unità di trattamento dei liquidi
Il sistema di trattamento dei liquidi del TED è formato da tre pompe di azionamento a siringa (“pompe 1 – 3”, ciascuna dotata di una valvola rotativa (Figura 1). Un alimentatore fornisce pompe 1 – 3 con 24 V DC. La comunicazione con il software di controllo (scritto in Visual Basic e C++) avviene tramite un’interfaccia RS232 per pompare 1. I comandi sono distribuiti attraverso le porte di espansione I/O seriali dalla pompa 1 alle pompe 2-3. Le pompe 1-3 sono dotate di siringhe di vetro (‘siringhe 1-3’, qui usiamo siringhe da 250 μL/zero volume morto). Ogni valvola ha due posizioni, ‘load’ e ‘dispense’. La posizione di “carico” viene utilizzata per aspirare il campione nella siringa. Un pezzo corto (~ 3 – 4 cm) di tubi in Flangia IN F.D. da 1/16″ O.D., 0,01′′ I.D. FEP è collegato tramite raccordi senza flangia ETFE/ETFE alla posizione di “carico” delle valvole 1-3. Questo breve pezzo di tubo raggiunge il serbatoio del campione (in genere un tubo di plastica da 1,5 ml o 0,5 ml). La posizione “dispense” porta all’ugello di spruzzatura. Il collegamento tra l’uscita ‘dispense’ e l’ugello spray è costituito da tubi in PE (~ 20-30 cm di lunghezza, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.), con un breve pezzo di tubo manicotto (~ 0,5 cm) e raccordi senza flangia ETFE/ETFE.
Lo stantuffo pneumatico
Il TED utilizza uno stantuffo pneumatico per accelerare la griglia e spostarla attraverso lo spray campione nel contenitore di etano liquido. Le pinzette a pressione negativa tengono la griglia, avvitata in un supporto costruito in casa che è montato su un cilindro pneumatico a doppia asta (Figura 2A).
La pressione viene fornita da una grande bombola di azoto gassoso (taglia W), dotata di un regolatore multistadio (0 – 10 bar, “pressione principale”). Il tubo flessibile in PVC rinforzato (12 mm O.D.) collega il regolatore a un collettore a 12 porte in cui l’azoto pressurizzato viene erogato all’ugello e allo stantuffo pneumatico. Il flusso di gas attraverso l’ugello è costante, regolato direttamente sul cilindro di azoto (pressione principale). Il collegamento all’ugello è realizzato con tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un breve pezzo di tubo in PE (~ 8 cm di lunghezza, 0,043″ O.D., 0,015″ I.D.) e appositi connettori. La pressione sullo stantuffo pneumatico è controllata attraverso un’elettrovalvola. Il tubo in PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) collega l’elettrovalvola con un regolatore e lo stantuffo pneumatico, per consentire una ridotta pressione di immersione (≤ pressione principale). L’elettrovalvola è controllata da computer. Una panoramica schematica dell’installazione è fornita nella Figura 2B.
Si noti che con questa configurazione la pressione di immersione è sempre uguale o inferiore alla pressione del gas spray (pressione principale). Tuttavia, la configurazione può essere facilmente modificata incorporando un secondo regolatore a monte dell’ugello di spruzzatura per consentire velocità di immersione più elevate a bassa pressione del gas di spruzzatura. Alte pressioni (>> 2 bar) possono danneggiare l’ugello di spruzzatura PDMS.
ATTENZIONE: Questo è un sistema pressurizzato e la “pressione principale” deve essere sempre < 7 bar.
Le pressioni comprese tra 0,5 e 2 bar sono tipicamente utilizzate per lo stantuffo pneumatico e mostrano una relazione approssimativamente lineare tra pressione e velocità (nella posizione verticale dello spruzzo). Le velocità di immersione sono misurate con un oscilloscopio, collegato in linea con un potenziometro a scorrimento (10 kΩ) e in parallelo con un resistore da 2 kΩ (Figura 2C). Un alimentatore fornisce il potenziometro con 9 V DC. Mentre la velocità approssimativa del tuffo viene impostata prima dell’esperimento impostando la pressione del tuffo, il potenziometro fornisce una lettura precisa della velocità dopo l’esperimento.
Ugelli spray e contenitore di etano liquido
La fabbricazione e il funzionamento di ugelli virtuali gasdinamici per la consegna di campioni a spruzzo sono stati descritti altrove in dettaglio15. Come descritto sopra, le uscite “erogate” delle valvole 1-3 sono collegate alle prese liquide dell’ugello (Figura 3A). Il gas spray pressurizzato è collegato all’ingresso del gas dell’ugello. Gli assi di aspirazione negli ugelli di spruzzatura PDMS sono tali che i tubi in PE O.D. da 0,043″ possono essere utilizzati direttamente senza la necessità di raccordi. Il nostro design dell’ugello contiene una geometria “jet-in-jet” per la miscelazione di due campioni, simile al dispositivo descritto nel rif.18. Uno schema del progetto è mostrato in Figura 3B, un’immagine microscopica di un ugello è mostrata in Figura 3C. Il layout del dispositivo microfluidico richiede l’uso di tre siringhe per mescolare due campioni. L’ugello di spruzzatura è in genere posizionato a una distanza di 1-1,5 cm dalla griglia (durante l’applicazione del campione).
Usiamo l’etano liquido come criogeno, in un contenitore liquido di etano / azoto come utilizzato per il metodo di blotting standard. Il posizionamento verticale della tazza di etano liquido si ottiene con una piattaforma elevata da laboratorio.
Controllo dell’ambiente di spruzzatura e griglia
Lo stantuffo e l’ugello di spruzzatura sono contenuti all’interno di una scatola in PMMA (vetro acrilico) costruita su misura con una doppia porta(Figura 4A). L’elevata umidità relativa all’interno della scatola è ottenuta da un sistema di umidificazione dell’aria sul retro del TED (Figura 4B). L’aria viene fornita da una pompa e immessa in un primo contenitore da 10 “(tipicamente utilizzato per la purificazione dell’acqua sotto il lavandino). Il contenitore è riempito con un basso (~ 5-10 cm) livello di acqua e ospita anche un’unità umidificatore. L’alimentazione di rete dell’umidificatore è controllata da un regolatore digitale di umidità/temperatura e da un sensore di umidità/temperatura situato all’interno della scatola di vetro acrilico. Il controller è impostato per spegnere la pompa quando l’umidità relativa raggiunge ≥ 90 %. L’aria umidificata dal primo contenitore viene pompata attraverso un diffusore, immersa in acqua in un secondo contenitore da 10 “e quindi entra nella scatola di vetro acrilico.
ATTENZIONE: Poiché il campione è aerosolizzato nell’ugello spray, i campioni biologici o chimici pericolosi non sono adatti come campioni.
La sequenza di esecuzione
Il pulsante Esegui script nel software di controllo avvia la sequenza di esecuzione. Questa sequenza di comandi può essere predefinita in un file di script e modificata tramite il software. Le variabili più importanti sono spiegate qui:
Velocità di spruzzatura: la velocità di spruzzatura determina la portata del liquido utilizzata dalla pompa della siringa. La portata può essere calcolata come segue: I motori della pompa a siringa utilizzati qui hanno una dimensione del gradino fissa. L’intera gamma della pompa è suddivisa in 48.000 gradini. Il secondo fattore importante è il volume della siringa. In genere utilizziamo siringhe da 250 μL. La velocità di spruzzatura nel software di controllo è impostata come numero di passi/secondo. Una velocità di spruzzatura di 1000 passi/secondo corrisponde a:
Volume di spruzzo: il volume di spruzzo determina il volume totale da spruzzare. Pertanto, determina anche la durata dello spray. Il volume di spruzzo nel software di controllo è impostato su una serie di passaggi. Un volume di spruzzo di 2000 passi, ad una velocità di spruzzo di 1000 passi/secondo, porta ad una durata di spruzzo di 2 s e un volume totale di 10,4 μL.
Tempo di pre-spruzzatura: questa variabile definisce il tempo che tra l’inizio dello spruzzo e l’immersione. È importante scegliere il tempo di ritardo in modo tale che lo spray abbia il tempo sufficiente per stabilizzarsi prima di immergere la griglia. Di solito, lo spray viene somministrato 1,5 – 4 s per stabilizzarsi prima che la griglia venga immersa. Lo spray viene mantenuto fino a quando la griglia non si è spostata. Di solito, il flusso di liquido (e quindi lo spray) viene interrotto da 0,5 a 1 s dopo che la griglia è stata immersa. Utilizzando una velocità di spruzzatura di 1000 passi / s e un volume di spruzzo di 2000 passi, un tempo tipico di pre-spruzzatura è di 1,5 s, ad esempio.
Una sequenza esemplare di comandi è mostrata nella Figura 5A, la posizione della griglia nel tempo è illustrata nella Figura 5B.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli in questo lavoro possono essere utilizzati per la preparazione rapida della griglia mediante spruzzatura diretta ed esperimenti TrEM. La preparazione rapida della griglia può essere utilizzata per ridurre le interazioni delle particelle con l’interfaccia aria-acqua5. Le principali limitazioni sono la concentrazione del campione disponibile e lo spessore del ghiaccio sulla griglia. Entro questi limiti e a condizione che la qualità del campione sia buona, il protocollo produce griglie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Molly S.C. Gravett per le discussioni utili e lo staff della struttura ABSL per l’aiuto con la raccolta dei dati crio-EM. David P. Klebl è uno studente di dottorato del programma di dottorato di 4 anni Wellcome Trust presso l’Astbury Centre finanziato dall’Università di Leeds. I microscopi FEI Titan Krios sono stati finanziati dall’Università di Leeds (premio UoL ABSL) e wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione BBSRC a Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) e supportato da sovvenzioni di ricerca a Howard D. White dell’American Heart Association (AMR21-236078) e Howard D. White e Vitold Galkin del National Institutes of Health degli Stati Uniti (171261).
Materials
| Time resolved device | |||
| acrylic glass box | USA scientific | ||
| digital humidity/temperature controller | THE20 digital humidity/temperature controller | ||
| dual rod pneumatic cylinder | dual rod pneumatic cylinder TN 10×70 | ||
| FEP tubing | Upchurch Scientific 1/16” O.D., 0.01'' I.D. FEP tubing | ||
| flangeless fittings | Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings | ||
| flexible reinforced PVC tubing | 12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing | ||
| glass syringes | Kloehn 250 µL zero-dead volume | ||
| humidifier pump | Interpret Aqua Air AP3 | ||
| liquid ethane container | from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV | ||
| multistage regulator | GASARC class 3 multistage regulator | ||
| negative pressure tweezers | Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers | ||
| oscilloscope | Hantek 6022BE oscilloscope | ||
| PE tubing | Scientific Commodities Inc. 0.043” O.D., 0.015” I.D. PE tubing | ||
| power supply | Mean Well GSM160A24-R7B | ||
| power supply | Wanptek KPS305D power supply | ||
| PU tubing | SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing | ||
| regulator | Norgren R72G-2GK-RMN | ||
| slide potentiometer | PS100 slide potentiometer | ||
| solenoid valve | SMC NVJ314M solenoid valve | ||
| syringe drive pumps | Kloehn V6 48K model | ||
| Reagents & Materials | |||
| apoferritin from equine spleen | Sigma-Aldrich, A3660 | ||
| ATP | Sigma-Aldrich, A2383 | ||
| cryo-EM grids | Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3 | ||
| EGTA | Sigma Aldrich E3889 | ||
| F-actin | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1) | ||
| glow-discharger | Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich, H7006 | ||
| KAc | Sigma-Aldrich, P1190 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, M8266 | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich, M1254 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, S9888 | ||
| Skeletal muscle myosin S1 | Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2) | ||
| Ref 1 | Spudich, J. A. & Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971). | ||
| Ref 2 | White, H. & Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochimica 15, 5818-5826 (1976). |
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