Produktion af membranfiltrerede faseskiftdecafluorobutan nanodråber fra præformede mikrobubbles

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at generere store mængder lipid indkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjælp af sonde-tip sonikering og efterfølgende kondensere dem i fase-shift nanodroplets ved hjælp af højtryk ekstrudering og mekanisk filtrering.

Abstract

Der er mange metoder, der kan bruges til produktion af vaporizable fase-shift dråber til billeddannelse og terapi. Hver metode bruger forskellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange af disse fremstillingsmetoder resulterer i polydispersepopulationer med ikke-ensartede aktiveringstærskler. Derudover kræver styring af dråbestørrelserne typisk stabile perfluorcarbonvæsker med høje aktiveringstærskler, der ikke er praktiske in vivo. Produktion af ensartede dråbestørrelser ved hjælp af lavkogende punktgasser ville være gavnligt for in vivo imaging og terapi eksperimenter. I denne artikel beskrives en enkel og økonomisk metode til dannelse af størrelsesfiltrerede lipid-stabiliserede faseskift nanodråber med lavkogende punktdecafluorobutan (DFB). En fælles metode til fremstilling af lipidmikrobubbles er beskrevet, ud over en ny metode til at kondensere dem med højtryksekstrudering i et enkelt trin. Denne metode er designet til at spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mængder mikrobubble- og nanodråbeløsninger til en lang række applikationer ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr, der findes i mange biologiske laboratorier.

Introduction

Ultralyd kontrast agenter (UCAs) er hastigt stigende i popularitet for billedbehandling og terapi applikationer. Mikrokøb, de oprindeligeucas, er i øjeblikket mainstream agenter, der anvendes i kliniske diagnostiske applikationer. Mikrobobler er gasfyldte kugler, typisk 1-10 μm i diameter, omgivet af lipid, protein eller polymer ^skaller1. Deres størrelse og in vivo stabilitet kan dog begrænse deres funktionalitet i mange applikationer. Faseskift nanodroplets, som indeholder en overophedet flydende kerne, kan overvinde nogle af disse begrænsninger på grund af deres mindre størrelse og forbedrede ^{cirkulation-liv2}. Når den overophedede væskekerne udsættes for varme eller akustisk energi, fordampes den til at danne en gasmikrobubble2,3,4,5. Da fordampningstærsklen er direkte relateret til ^{dråbestørrelse5,6}, ville det være meget ønskeligt at formulere dråbeaffjedring med ensartet størrelse for at opnå ensartede aktiveringstærskler. Formuleringsmetoder, der producerer ensartede dråbestørrelser, er ofte komplekse og dyre, mens mere omkostningseffektive tilgange resulterer i polydisperseløsninger7. En anden begrænsning er evnen til at generere stabile faseskiftdråber med lavkogende punkt perfluorcarbon (PFC) gasser, som er afgørende for effektiv aktivering in ^vivo8. I dette manuskript er en protokol beskrevet til generering af stabile filtrerede lavkogningspunkt fordampelige faseskiftdråber til in vivobilleddannelse og terapiapplikationer.

Der er mange metoder til fremstilling af monodispersed submicron fase-skift ^dråber7. En af de mest robuste metoder til styring af størrelse er brugen af mikrofluidiske enheder. Disse enheder kan være dyre, har langsomme dråber produktion (~ 104-106 dråber / s)⁷, og kræver omfattende uddannelse. Mikrofluidiske enheder kræver også generelt gasser med høj kogepunkt for at undgå spontan fordampning og tilstopning af ^systemet7. En nylig undersøgelse foretaget af de Gracia Lux et ^al.9 viser imidlertid, hvordan køling af et mikrofluidizer kan bruges til at generere høje koncentrationer af faseskift under mikron (1010-1012/mL) ved hjælp af lavt kogepunktdecafluorobutan (DFB) eller octafluoropropan (OFP).

Generelt er lavkognitsgasser som DFB eller OFP lettere at håndtere ved hjælp af præformede gasbobler. Vaporizable dråber kan fremstilles af prækursor lipid-stabiliseret bobler ved at kondensere gassen ved hjælp af lave temperaturer og forhøjet ^tryk5,10. Koncentrationen af dråber produceret ved hjælp af denne metode afhænger af prækursor mikrobubble koncentration og effektiviteten af konvertering af bobler til dråber. Koncentreret mikrobobler er blevet rapporteret fra tip sonikering nærmer sig > ¹⁰¹⁰ MB/^mL11, mens en separat undersøgelse har rapporteret dråbe koncentrationer spænder fra ~ 1-3 ^x1011 dråber / mL fra kondenseret OFP og DFP ^bobler12. Når monodispersed dråber ikke er et problem, kondensering metoder er de mest ligetil og billigste metoder til at generere lipid-stabiliseret fase-skift dråber ved hjælp af lavkogning punkt PFC’er. Metoder til at generere ensartet størrelse bobler før kondensering kan bidrage til at skabe mere monodisperse populationer af dråber. Det er imidlertid også vanskeligt at generere monodisperse prækursorbobler, hvilket kræver dyrere tilgange såsom mikrofluidics eller gentagne differentialcentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilgang til produktion af DFB og OFB nanodroplets er for nylig blevet offentliggjort ved hjælp af spontan nukleation af dråber i ^liposomer13. Denne metode, udnytte en “Ouzo” effekt, er en enkel måde at generere lavkogning punkt PFC dråber uden at skulle kondensere bobler. Størrelsesfordelingen af PFC-dråberne kan styres af delikat titrering og blanding af PFC-, lipid- og ethanolkomponenter, der bruges til at starte nukleation af dråberne. Det er også værd at bemærke, at blanding af perfluorcarboner kan bruges til at kontrollere stabilitet og aktivering tærskler for ^{nanodroplets14,15}. Nyere arbejde af Shakya et al. viser, hvordan aktivering af nanodråbe kan indstilles ved at emulgere højkogningpunkt-PFC’er i et kulbrinte endoskelet for at lette heterogen nukleation i ^{dråbekernen16}, hvilket er en tilgang, der kan overvejes sammen med andre former for filtrering af dråbestørrelse.

Når de er dannet, kan faseskiftdråber ekstruderes efter dannelse for at skabe flere monodispersepopulationer. Faktisk er en lignende protokol til den metode, der er beskrevet her, tidligere blevet offentliggjort af Kopechek et ^al.17 ved hjælp af høj kogepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråbekernen. Læsere, der søger at bruge faseskiftdråber med højkogningspunkt perfluorcarboner (stabile ved stuetemperatur), bør i stedet henvise til artiklen ovenfor. Generering og ekstrudering af dråber med lav kogepunkt gasser, såsom DFB og OFP, er mere kompliceret og er bedst gribes an ved at kondensere præformede gasbobler.

I denne protokol, en fælles metode til at generere præformede lipid mikrobubbles med en DFB gas kerne ved hjælp af sonde tip sonikering er beskrevet. Dernæst bruges en kommerciel ekstruder til at kondensere præformede mikrobubbles i submicron faseskift nanodråber (figur 1). De resulterende dråber kan derefter aktiveres ved varme og ultralyd. Denne metode kan producere større mængder nanodråbeopløsning end konventionelle kondensmetoder med smallere størrelsesfordelinger uden behov for dyre mikrofluidiske enheder. Produktionen af nanodråbeløsninger med smal størrelsesfordelinger kan sandsynligvis generere mere ensartede fordampningstærskler. Dette vil maksimere deres potentiale for mange applikationer såsom billeddannelse, ablation, lægemiddellevering, og embolisering1,3,4,6.

Figur 1: Skematisk af højtryksekstruderingsopsætning til kondenserende præformede mikrobubbles i faseskift nanodråber. Mikrobobbleopløsning tilsættes og er indeholdt i ekstruderkammeret, og 250 psi fra nitrogentanken påføres gennem kammerets indløbsventil. Nitrogengassen vil skubbe mikrobobbleopløsningen gennem filteret i bunden af kammeret og kondensere prøven til nanodråber. Opløsningen skubbes til sidst ud af ekstruder gennem prøveudtagrøret og opsamles. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Gør lipid film Forbered lipidfilm til mikrobubblegenerering ved hjælp af 90% DSPC og 10% DSPE-PEG2K ved at blande lipiderne i det korrekte forhold ved hjælp af følgende retninger: Lav stock lipider af DSPC og DSPE-PEG2K i kloroform. Veje 50 mg af hver lipid pulver i separate hætteglas. Tilsæt 1 mL kloroform til hvert hætteglas ved hjælp af en 1 mL glassprøjte. Der tilsættes 287 μL DSPC-lager og 113 μL DSPE-PEG2K-lager (begge 50 mg/mL) i et 20 mL scintillationsglas med en glassp…

Representative Results

Repræsentative resultater af størrelsesfordelingen er inkluderet ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) og tunable resistiv pulsmåling (TRSP) analyse. Figur 5 viser størrelsesfordelingen af kondenserede bobleopløsninger med og uden ekstrudering. Uden ekstrudering slutter protokollen ved trin 5.3. De afkølede bobler kondenseres ved at udlufte prøven til atmosfærisk tryk, mens det er koldt. Den kondenserede eneste prøve har en meget bredere fordeling centreret nær 400 nm. Den ekst…

Discussion

En omfattende mængde litteratur er tilgængelig, der diskuterer formulering, fysik og potentielle anvendelser af mikrobobler og faseskiftdråber til in vivo imaging og terapi. Denne diskussion vedrører eksplicit at generere lipid mikrobubbles og konvertere dem til sub-mikron fase-shift dråber ved hjælp af et lavt kogepunkt DFB gas og højtryk ekstrudering. Den metode, der er skitseret her, er beregnet til at give en relativt enkel metode til fremstilling af store mængder lipidmikrobubbles og DFB faseskiftdråber ved…

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets