Produktion av membranfiltrerade fasförskjutningsdekafluorbutannanodroppar från förformade mikrobubblor

Summary

Detta protokoll beskriver en metod för att generera stora volymer av lipid inkapslade decafluorobutane microbubbles med hjälp av sond-tips ultraljudsbehandling och därefter kondensera dem till fas-skift nanodroplets med högtryck extrudering och mekanisk filtrering.

Abstract

Det finns många metoder som kan användas för produktion av vaporizable fas-shift droppar för avbildning och terapi. Varje metod använder olika tekniker och varierar i pris, material och syfte. Många av dessa tillverkningsmetoder resulterar i polydisperspopulationer med icke-enhetliga aktiveringströsklar. Dessutom kräver styrning av droppstorlekarna vanligtvis stabila perfluorkarbonvätskor med höga aktiveringströsklar som inte är praktiska in vivo. Att producera enhetliga droppar storlekar med låg kokpunkt gaser skulle vara fördelaktigt för in vivo imaging och terapi experiment. Denna artikel beskriver en enkel och ekonomisk metod för bildandet av storlek-filtrerade lipid-stabiliserade fas-skift nanodroppar med låg kokpunkt decafluorobutane (DFB). En vanlig metod för att generera lipidmikrobubblor beskrivs, förutom en ny metod för att kondensera dem med högtrycksprofilering i ett enda steg. Denna metod är utformad för att spara tid, maximera effektiviteten och generera större volymer av mikrobubble- och nanodropletlösningar för en mängd olika tillämpningar med hjälp av vanlig laboratorieutrustning som finns i många biologiska laboratorier.

Introduction

Ultraljud kontrastmedel (UCAs) växer snabbt i popularitet för imaging och terapi applikationer. Microbubbles, de ursprungliga UCAs, är för närvarande de vanliga agenterna som används i kliniska diagnostiska applikationer. Mikrobubblor är gasfyllda sfärer, vanligtvis 1-10 μm i diameter, omgivna av lipid-, protein- eller ^polymerskal1. Deras storlek och in vivo-stabilitet kan dock begränsa deras funktionalitet i många applikationer. Fasförskjutningsnanodroppar, som innehåller en överhettad vätskekärna, kan övervinna några av dessa begränsningar på grund av deras mindre storlek och förbättrade ^{cirkulationslivslängd2}. När den överhettade vätskekärnan utsätts för värme eller akustisk energi förångas den till en gasmikrobubble2,3,4,5. Eftersom förångningströskeln är direkt relaterad till ^{droppstorlek5,6}, skulle det vara mycket önskvärt att formulera droppfjädringar med enhetlig storlek för att uppnå konsekventa aktiveringströsklar. Formuleringsmetoder som producerar enhetliga droppstorlekar är ofta komplexa och kostsamma, medan mer kostnadseffektiva metoder resulterar i polydisperselösningar7. En annan begränsning är förmågan att generera stabila fasförskjutningsdroppar med PFC-gaser (Low-boiling Point perfluorocarbon), vilket är avgörande för effektiv aktivering in ^vivo8. I detta manuskript beskrivs ett protokoll för att generera stabila filtrerade låg kokpunkt vaporizable fas-shift droppar för in vivo imaging och terapi applikationer.

Det finns många metoder för att producera monodispersed submicron fasförskjutning ^droppar7. En av de mest robusta metoderna för att kontrollera storleken är användningen av mikrofluidiska enheter. Dessa enheter kan vara kostsamma, ha långsam produktion av droppar (~ 104-106 droppar / s) ⁷ och kräver omfattande utbildning. Mikrofluidiska enheter kräver också i allmänhet gaser med hög kokpunkt för att undvika spontan förångning och igensättning av ^systemet7. En ny studie av de Gracia Lux et ^al.9 visar dock hur kylning av en mikrofluidizer kan användas för att generera höga koncentrationer av submikrinfasförskjutning (1010-1012/ml) med låg kokpunkt dekafluorbutan (DFB) eller octafluorpropan (OFP).

I allmänhet är gaser med låg kokpunkt som DFB eller OFP lättare att hantera med förformade gasbubblor. Vaporizable droppar kan produceras från föregångare lipid-stabiliserade bubblor genom att kondensera gasen med låga temperaturer och förhöjt ^tryck5,10. Koncentrationen av droppar som produceras med denna metod beror på prekursormikrobubblekoncentration och effektiviteten av omvandling av bubblor till droppar. Koncentrerade mikrobubblor har rapporterats från tips ultraljudsbehandling närmar sig > ¹⁰¹⁰ MB/^mL11, medan en separat studie har rapporterat droppkoncentrationer som sträcker sig från ~1-3 ^x1011 droppar/mL från kondenserade OFP och DFP ^bubblor12. När monodispersed droppar inte är ett problem, kondensation metoder är de enklaste och lägsta kostnadsmetoderna för att generera lipidstabiliserade fasförskjutning droppar med låg kokpunkt PFC. Metoder för att generera enhetliga storlek bubblor innan kondensering kan bidra till att skapa mer monodisperse populationer av droppar. Att generera monodisperse prekursorbubblor är dock också svårt, vilket kräver dyrare metoder som mikrofluidik eller upprepade differentialcentrifugeringstekniker11. Ett alternativt tillvägagångssätt för att producera DFB och OFB nanodroppar har nyligen publicerats med hjälp av spontana nukleering av droppar i ^liposomer13. Denna metod, med hjälp av en “Ouzo” -effekt, är ett enkelt sätt att generera PFC-droppar med låg kokpunkt utan att behöva kondensera bubblor. Storleksfördelningen av PFC droppar kan styras genom delikat titrering och blandning av PFC, lipid och etanol komponenter som används för att initiera nukleation av dropparna. Det är också värt att notera att blandning av perfluorkarboner kan användas för att kontrollera stabilitets- och aktiveringströsklar för ^{nanodroppar14,15}. Nyare arbete av Shakya et al. visar hur nanodropletaktivering kan justeras genom att emulgera höga kokpunkts-PFC inom ett kolväteendoskelett för att underlätta heterogen nukleation inom ^{droppkärnan16}, vilket är ett tillvägagångssätt som kan övervägas tillsammans med andra former av filtrering av droppstorlek.

När de har bildats kan fasförskjutningsdroppar extruderas efter bildandet för att skapa fler monodisperse populationer. Faktum är att ett liknande protokoll som den metod som beskrivs här har publicerats tidigare av Kopechek et ^al.17 med hjälp av hög kokpunkt dodecofluorpentane (DDFP) som droppkärna. Läsare som försöker använda fasförskjutningsdroppar med hög kokpunkt perfluorkarboner (stabila vid rumstemperatur) bör hänvisa till artikeln ovan istället. Att generera och extrudera droppar med låg kokpunktsgaser, såsom DFB och OFP, är mer komplicerat och kontaktas bäst genom att kondensera förformade gasbubblor.

I detta protokoll beskrivs en vanlig metod för att generera förformade lipid microbubbles med en DFB gas kärna med hjälp av sond tips ultraljudsbehandling. Därefter används en kommersiell extruder för att kondensera förformade mikrobubblor till submicronfasförskjutningsnanodroppar (figur 1). De resulterande dropparna aktiveras sedan med värme och ultraljud. Denna metod kan producera större volymer nanodropletlösning än konventionella kondensationsmetoder med smalare storleksfördelningar utan behov av dyra mikrofluidiska enheter. Produktion av nanodropletlösningar med smala storleksfördelningar kan sannolikt generera mer enhetliga förångningströsklar. Detta kommer att maximera deras potential för många applikationer såsom avbildning, ablation, läkemedelsleverans och embolization1,3,4,6.

Bild 1: Schematisk högtrycksprofilering för kondensering av förformade mikrobubblor till fasförskjutningsnanodroppar. Mikrobubblelösning tillsätts till och finns i extruderkammaren, och 250 psi, från kvävetanken, appliceras genom kammarens inloppsventil. Kvävegasen kommer att driva mikrobubblelösningen genom filtret vid kammarens botten och kondensera provet till nanodroppar. Lösningen trycks slutligen ut ur extrudern genom provutloppsröret och samlas in. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Protocol

1. Göra lipidfilmer Förbered lipidfilmer för mikrobubblegenerering med 90% DSPC och 10% DSPE-PEG2K genom att blanda lipiderna i rätt förhållande med följande anvisningar: Gör lagerfetter av DSPC och DSPE-PEG2K i kloroform. Väg 50 mg av varje lipidpulver i separata injektionsflaska. Tillsätt 1 ml kloroform till varje flaska med en 1 ml glasspruta. Tillsätt 287 μL DSPC-buljong och 113 μL DSPE-PEG2K-buljong (båda 50 mg/ml) i en 20 ml scintillationsflaska med en glasspruta. <…

Representative Results

Representativa resultat av storleksfördelningen ingår med hjälp av analys av dynamisk ljusspridning (DLS) och tunable resistiv pulsavkänning (TRSP). Figur 5 visar storleksfördelningen för kondenserade bubbellösningar med och utan extrudering. Utan extrudering slutar protokollet vid steg 5.3. De kylda bubblorna kondenseras genom att provet ventileras till atmosfärstryck medan det är kallt. Det kondenserade endast provet har en mycket bredare fördelning centrerad nära 400 nm. Det ex…

Discussion

En omfattande mängd litteratur finns tillgänglig som diskuterar formulering, fysik och potentiella tillämpningar av microbubbles och fas-skift droppar för in vivo imaging och terapi. Denna diskussion gäller uttryckligen att generera lipidmikrobubblor och omvandla dem till sub-micron fasförskjutning droppar med hjälp av en låg kokpunkt DFB gas och högtryck extrudering. Metoden som beskrivs här är avsedd att ge en relativt enkel metod för att producera stora mängder lipidmikrobubblor och DFB fasförskjutningsd…

Materials

15 mL Centrifuge Tubes	Falcon	352095	Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter	Whatman	110606	Extruder filters
2-methylbutane	Fisher Chemical	03551-4	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2	Fisher	02-217-002	Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn	Branson	101-063-198R	Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator	Fisher Scientific	15337402	Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-4	Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas	FluoroMed L.P.	1 kg	generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice	–	–	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder	NOF America	COATSOME MC-8080	Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder	NOF America	SUNBRIGHT DSPE-020CN	Component of lipid film
General Thermometer	–	–	Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes	Hamilton	81139	Used to mix lipids in chloroform
Glycerol	Fisher Bioreagents	BP229-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block	VWR Scientific Products		Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder	Evonik		Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer	Fisher brand	14-955-151	Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank	–	–	Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline	Fisher Scientific		Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk	Whatman	230600	Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps	Fisher Scientific	298417	Used for solution storage
Propylene Glycol	Fisher Chemical	P355-1	Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials	DWK Life Sciences Wheaton	986532	Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer	–	–	Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container	Medegen	79310	Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube	Fisher	02682004	Used for concentrating nanodroplets