تقدم هذه الدراسة تطبيق شرائح أنسجة البنكرياس الحية لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وتفاعلات الخلايا المناعية الجزيرية.
شرائح أنسجة البنكرياس الحية تسمح لدراسة فسيولوجيا الجزيرة وظيفة في سياق محيط جزيرة صغيرة سليمة. يتم إعداد شرائح من أنسجة البنكرياس البشرية والفأرة الحية جزءا لا يتجزأ من agarose وقطع باستخدام هزاز. تسمح هذه الطريقة للأنسجة بالحفاظ على مقومات البقاء والوظيفة بالإضافة إلى الحفاظ على الأمراض الأساسية مثل النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D). طريقة شريحة تمكن اتجاهات جديدة في دراسة البنكرياس من خلال الحفاظ على الهياكل المعقدة والتفاعلات بين الخلايا المختلفة التي تشكل الغدد الصماء والأنسجة الخارجية للبنكرياس. يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء تلطيخ ومجهر الفاصل الزمني للخلايا المناعية الذاتية الحية داخل شرائح البنكرياس جنبا إلى جنب مع تقييمات فسيولوجيا الجزيرة. علاوة على ذلك ، يمكن صقل هذا النهج لتمييز مجموعات الخلايا المناعية المحددة لمضادات خلايا الجزيرة باستخدام الكواشف المعقدة متعددة ال مرسلات الهستوباتية الرئيسية.
مشاركة البنكرياس هو pathognomonic لأمراض مثل التهاب البنكرياس, T1D, و T2D1,2,3. دراسة وظيفة في الجزر المعزولة وعادة ما ينطوي على إزالة الجزر من البيئة المحيطة بها4. تم تطوير طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية للسماح لدراسة أنسجة البنكرياس مع الحفاظ على البيئة الدقيقة للجزر سليمة وتجنب استخدام إجراءات عزل الجزر المجهدة5،6،7. وقد استخدمت بنجاح شرائح أنسجة البنكرياس من الأنسجة المانحة البشرية لدراسة T1D وأظهرت عمليات فقدان خلايا بيتا والخلل الوظيفي بالإضافة إلى تسلل الخلايا المناعية8,9,10,11,12,13. يمكن تطبيق طريقة شريحة أنسجة البنكرياس الحية على كل من أنسجة البنكرياس الماوس والإنسان5,6,8. يتم الحصول على شرائح أنسجة البنكرياس البشرية من الأنسجة المانحة للأعضاء من خلال التعاون مع شبكة المتبرعين بأعضاء البنكرياس المصابين بالسكري (nPOD). يمكن إنشاء شرائح الماوس من مجموعة متنوعة من سلالات الماوس المختلفة.
سيركز هذا البروتوكول على إعادة دمج السكري غير البدين لتفعيل الجينات-1-null (NOD. Rag1-/-) ومستقبلات الخلايا التائية المعدلة وراثيا (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) سلالات الماوس. موافقه. راغ1/- الفئران غير قادرة على تطوير الخلايا T و B بسبب اضطراب في الجين تنشيط إعادة التركيب 1 (Rag1)14. موافقه. Rag1-/-. تستخدم الفئران AI4 α/β كنموذج لمرض السكري من النوع 1 المتسارع لأنها تنتج استنساخ خلية T واحدة تستهدف سطح الأنسولين ، مما يؤدي إلى تسلل جزيرة ثابتة وتطور سريع للأمراض15. يصف البروتوكول المعروض هنا إجراءات الدراسات الوظيفية والمناعية باستخدام شرائح البنكرياس البشرية والفأرة الحية من خلال تطبيق نهج المجهر الكونفوكوكال. وتشمل التقنيات الموصوفة هنا تقييمات الجدوى، وتحديد الجزيرة وموقعها، وتسجيلات Ca2+ السيتوسوليك، فضلا عن تلطيخ وتحديد مجموعات الخلايا المناعية.
الهدف من هذا البروتوكول هو شرح توليد شرائح البنكرياس والإجراءات اللازمة لتوظيف شرائح في الدراسات الوظيفية والمناعية. هناك العديد من الفوائد لاستخدام شرائح البنكرياس الحية. ومع ذلك ، هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي تعتبر ضرورية للأنسجة لتبقى قابلة للحياة ومفيدة خلال بروتوكولات التج?…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح R01 DK123292، T32 DK108736، UC4 DK104194، UG3 DK122638، وP01 AI042288. وقد أجريت هذه البحوث بدعم من شبكة المتبرعين أعضاء البنكرياس مع مرض السكري (nPOD; RRID:SCR_014641)، وهو مشروع بحثي تعاوني من النوع 1 لمرض السكري برعاية JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)، وليونا م. وهاري ب. هيلمسلي الخيرية الاستئمانية (غرانت #2018PG-T1D053). المحتوى والآراء التي أعرب عنها هي مسؤولية المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهة النظر الرسمية للnPOD. يتم سرد منظمات شراء الأعضاء (OPO) بالشراكة مع nPOD لتوفير موارد البحث في http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. شكرا للدكتور كيفن أوتو، جامعة فلوريدا، لتوفير هزاز المستخدمة لتوليد شرائح الماوس.
#3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
50 mL syringe | BD | 309653 | |
8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
ddiH2O | |||
Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
FBS | Gibco | 10082147 | |
Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
Microwave | GE | JES1460DSWW | |
Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |