Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant
Summary
Cette étude présente l’application de tranches de tissu pancréatique vivant à l’étude de la physiologie des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires.
Abstract
Les tranches de tissu pancréatique vivant permettent d’étudier la physiologie et la fonction des îlots dans le contexte d’un microenvironnement intact des îlots. Les tranches sont préparées à partir de tissu pancréatique humain et souris vivant incorporé dans l’agarose et coupées à l’aide d’un vibratome. Cette méthode permet au tissu de maintenir sa viabilité et sa fonction en plus de préserver les pathologies sous-jacentes telles que le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). La méthode des tranches permet de nouvelles directions dans l’étude du pancréas grâce au maintien des structures complexes et des diverses interactions intercellulaires qui composent les tissus endocriniens et exocrines du pancréas. Ce protocole montre comment effectuer la coloration et la microscopie en accéléré de cellules immunitaires endogènes vivantes dans des tranches pancréatiques ainsi que des évaluations de la physiologie des îlots. De plus, cette approche peut être affinée pour discerner les populations de cellules immunitaires spécifiques aux antigènes des cellules des îlots à l’aide de réactifs complexes-multimères d’histocompatibilité majeurs.
Introduction
L’implication du pancréas est pathognomonique à des maladies telles que la pancréatite, le DT1 et le DT21,2,3. L’étude de la fonction dans les îlots isolés implique généralement l’élimination des îlots de leur environnement4. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant a été développée pour permettre l’étude du tissu pancréatique tout en maintenant des microenvironnements intacts des îlots et en évitant l’utilisation de procédures stressantes d’isolement des îlots5,6,7. Des tranches de tissu pancréatique provenant de tissus de donneurs humains ont été utilisées avec succès pour étudier le DT1 et ont démontré des processus de perte et de dysfonctionnement des cellules bêta en plus de l’infiltration de cellules immunitaires8,9,10,11,12,13. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant peut être appliquée à la fois au tissu pancréatique de la souris et du tissu pancréatique humain5,6,8. Les tranches de tissu pancréatique humain provenant de tissus de donneurs d’organes sont obtenues grâce à une collaboration avec le Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD). Les tranches de souris peuvent être générées à partir d’une variété de souches de souris différentes.
Ce protocole se concentrera sur la recombinaison diabétique non obèse activant le gène 1-null (NOD. Rag1-/-) et récepteur transgénique des lymphocytes T (AI4) (NOD. Chiffon1-/-. Souches de souris AI4 α/β). HOCHER. Les souris Rag1-/- sont incapables de développer des lymphocytes T et B en raison d’une perturbation du gène 1 (Rag1)14 activant la recombinaison. HOCHER. Chiffon1-/-. Les souris AI4 α/β sont utilisées comme modèle pour le diabète de type 1 accéléré parce qu’elles produisent un clone de lymphocytes T unique qui cible un épitope d’insuline, ce qui entraîne une infiltration constante des îlots et un développement rapide de la maladie15. Le protocole présenté ici décrit les procédures pour les études fonctionnelles et immunologiques utilisant des tranches pancréatiques humaines et de souris vivantes grâce à l’application d’approches de microscopie confocale. Les techniques décrites ici comprennent les évaluations de la viabilité, l’identification et la localisation des îlots, les enregistrements cytosoliques de Ca2+ , ainsi que la coloration et l’identification des populations de cellules immunitaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de ce protocole est d’expliquer la génération de tranches de pancréas et les procédures nécessaires pour utiliser les tranches dans des études fonctionnelles et immunologiques. Il y a de nombreux avantages à utiliser des tranches pancréatiques vivantes. Cependant, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour que le tissu reste viable et utile au cours des protocoles d’expérience décrits. Il est impératif de travailler rapidement. Le temps entre l’injection du pancréas et la générati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les subventions des NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 et P01 AI042288. Cette recherche a été réalisée avec le soutien du Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD; RRID:SCR_014641), un projet collaboratif de recherche sur le diabète de type 1 parrainé par FRDJ (nPOD : 5-SRA-2018-557-Q-R) et the Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Le contenu et les opinions exprimées relèvent de la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement le point de vue officiel de nPOD. Les organisations d’approvisionnement en organes (OPO) qui s’associent au nPOD pour fournir des ressources de recherche sont énumérées à http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Merci au Dr Kevin Otto, de l’Université de Floride, d’avoir fourni le vibratome utilisé pour générer des tranches de souris.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Riferimenti
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