מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.
פרוסות רקמת לבלב חיות מאפשרות לחקור פיזיולוגיה ותפקוד של איון בהקשר של מיקרו-סביבה שלמה של אי. פרוסות מוכנות מרקמת לבלב אנושית ועכבר חיה המוטבעת באגרוז וחותכת באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת לרקמה לשמור על כדאיות ותפקוד בנוסף לשימור פתולוגיות הבסיסיות כגון סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D). שיטת הפרוסה מאפשרת כיוונים חדשים בחקר הלבלב באמצעות תחזוקת המבנים המורכבים ואינטראקציות בין-תאיות שונות המרכיבות את הרקמות האנדוקריניות והאקסוקריניות של הלבלב. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע כתמים ומיקרוסקופיה בזמן לשגות של תאי מערכת החיסון אנדוגני חיים בתוך פרוסות הלבלב יחד עם הערכות של פיזיולוגיה של אי. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מעודנת כדי להבחין אוכלוסיות תאי החיסון ספציפיים עבור אנטיגנים תאי אי באמצעות ריאגנטים מורכבים-multimer היסטו-תאימות גדולה.
מעורבות הלבלב היא פתוגנומית למחלות כגון דלקת הלבלב, T1D ו- T2D1,2,3. חקר התפקוד באיים מבודדים כרוך בדרך כלל בהסרת האיים מסביבתם4. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה פותחה כדי לאפשר את חקר רקמת הלבלב תוך שמירה על מיקרו-סביבה שלמה של איונים והימנעות משימוש בהליכי בידוד איים מלחיצים5,6,7. פרוסות רקמת הלבלב מרקמת התורם האנושי שימשו בהצלחה לחקר T1D והפגינו תהליכים של אובדן תאי ביתא וחוסר תפקוד בנוסף לחדירה לתאי החיסון8,9,10,11,12,13. ניתן ליישם את שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה הן על העכבר והן על רקמת הלבלב האנושית5,6,8. פרוסות רקמת הלבלב האנושית מרקמות תורמי איברים מתקבלות באמצעות שיתוף פעולה עם הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD). פרוסות עכבר ניתן ליצור ממגוון של זני עכבר שונים.
פרוטוקול זה יתמקד ללא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null (NOD. ראג1-/-) וקולטן תא T מהונדס (AI4) (הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β) זני עכבר. הנהון. עכברי Rag1-/- אינם מסוגלים לפתח תאי T ו- B עקב הפרעה בגן מפעיל רקומבינציה 1 (Rag1)14. הנהון. ראג1-/-. עכברי AI4 α/β משמשים כמודל לסוכרת מסוג 1 מואצת מכיוון שהם מייצרים שיבוט תא T יחיד המכוון לאפיטופ של אינסולין, וכתוצאה מכך חדירת איים עקבית והתפתחות מחלה מהירה15. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר נהלים למחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים באמצעות פרוסות לבלב אנושיות ועכבר חיות באמצעות יישום של גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקות המתוארות כאן כוללות הערכות כדאיות, זיהוי איון ומיקום, הקלטות Ca2+ ציטוטוסוליות, כמו גם כתמים וזיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון.
מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את הדור של פרוסות הלבלב ואת ההליכים הדרושים כדי להעסיק את הפרוסות במחקרים פונקציונליים ואימוניולוגיים. ישנם יתרונות רבים לשימוש בפרוסות לבלב חיות. עם זאת, ישנם מספר צעדים קריטיים החיוניים עבור הרקמה להישאר קיימא ושימושי במהלך פרוטוקולי הניסוי המתוארים. זה הכר…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ו P01 AI042288. מחקר זה בוצע בתמיכת הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD; RRID:SCR_014641), פרויקט מחקר סוכרת מסוג 1 משותף בחסות JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), וקרן הצדקה של לאונה M. והארי ב. הלמסלי (גרנט #2018PG-T1D053). התוכן והשקפות המובעים הם באחריות המחברים ואינם משקפים בהכרח את ההשקפה הרשמית של nPOD. ארגונים לרכש איברים (OPO) משתפים פעולה עם nPOD כדי לספק משאבי מחקר רשומים ב- http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. תודה לד”ר קווין אוטו, אוניברסיטת פלורידה, על שסיפקת את הוויברטום ששימש ליצירת פרוסות עכבר.
#3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
50 mL syringe | BD | 309653 | |
8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
ddiH2O | |||
Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
FBS | Gibco | 10082147 | |
Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
Microwave | GE | JES1460DSWW | |
Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |