Observere holmefunksjon og islet-immune celleinteraksjoner i levende bukspyttkjertelvevskiver
Summary
Denne studien presenterer anvendelsen av levende bukspyttkjertelvev skiver til studiet av holme fysiologi og holme-immuncelle interaksjoner.
Abstract
Levende bukspyttkjertelvev skiver tillater studiet av holmefysiologi og funksjon i sammenheng med et intakt holmemikromiljø. Skiver fremstilles fra levende menneske- og muspankreasvev innebygd i agarose og kuttes ved hjelp av en vibratom. Denne metoden gjør det mulig for vevet å opprettholde levedyktighet og funksjon i tillegg til å bevare underliggende patologier som type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D). Skivemetoden muliggjør nye retninger i studiet av bukspyttkjertelen gjennom vedlikehold av de komplekse strukturene og ulike intercellulære interaksjoner som utgjør bukspyttkjertelens endokrine og eksokrine vev. Denne protokollen demonstrerer hvordan man utfører farging og tidsforløpmikroskopi av levende endogene immunceller i bukspyttkjertelskiver sammen med vurderinger av holmefysiologi. Videre kan denne tilnærmingen raffineres for å skjelne immuncellepopulasjoner som er spesifikke for holmecelleantigener ved hjelp av store histokompatibilitetskompleks-multimer reagenser.
Introduction
Involvering av bukspyttkjertelen er patognomisk for sykdommer som pankreatitt, T1D og T2D1,2,3. Studiet av funksjon i isolerte holmer innebærer vanligvis fjerning av holmene fra deres omkringliggende miljø4. Den levende bukspyttkjertelvevsskivemetoden ble utviklet for å tillate studiet av bukspyttkjertelvev samtidig som intakte holmemikromiljøet opprettholdes og unngår bruk av stressende holmeisolasjonsprosedyrer5,6,7. Bukspyttkjertelvev skiver fra humant donorvev har blitt vellykket brukt til å studere T1D og har demonstrert prosesser for betacelletap og dysfunksjon i tillegg til immuncelleinfiltrasjon8,9,10,11,12,13. Den levende bukspyttkjertelvevsskivemetoden kan brukes på både mus og humant bukspyttkjertelvev5,6,8. Humane bukspyttkjertelvev skiver fra organ donor vev er oppnådd gjennom et samarbeid med Nettverket for bukspyttkjertelen organ donorer med diabetes (nPOD). Museskiver kan genereres fra en rekke forskjellige musestammer.
Denne protokollen vil fokusere på ikke-overvektig diabetisk-rekombinasjon som aktiverer gen-1-null (NOD. Rag1-/-) og T-cellereseptortransgene (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) musestammer. NIKKE. Rag1-/- mus kan ikke utvikle T- og B-celler på grunn av forstyrrelser i det rekombinasjonsaktiverende genet 1 (Rag1)14. NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β mus brukes som modell for akselerert type 1 diabetes fordi de produserer en enkelt T-celle klone som retter seg mot en epitop av insulin, noe som resulterer i konsistent holmeinfiltrasjon og rask sykdomsutvikling15. Protokollen som er omtalt her beskriver prosedyrer for funksjonelle og immunologiske studier ved hjelp av levende bukspyttkjertelskiver for mennesker og mus gjennom bruk av konfiskeringsmikroskopitilnærminger. Teknikkene som er beskrevet her inkluderer levedyktighetsvurderinger, holmeidentifikasjon og plassering, cytosoliske Ca2 + opptak, samt farging og identifisering av immuncellepopulasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne protokollen er å utvise generering av bukspyttkjertelskiver og prosedyrene som trengs for å bruke skivene i funksjonelle og immunologiske studier. Det er mange fordeler med å bruke levende bukspyttkjertelskiver. Det er imidlertid flere kritiske trinn som er avgjørende for at vevet skal forbli levedyktig og nyttig under de beskrevne eksperimentprotokollene. Det er viktig å jobbe raskt. Tiden mellom å injisere bukspyttkjertelen og generere skivene på vibratomet bør minimeres for å opprettholde vev…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av NIH-tilskudd R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 og P01 AI042288. Denne forskningen ble utført med støtte fra Network for Pancreatic Organ donorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), et samarbeidsprosjekt av type 1 diabetes sponset av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) og The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Innholdet og synspunktene som uttrykkes er forfatternes ansvar og gjenspeiler ikke nødvendigvis det offisielle synet på nPOD. Organ Procurement Organizations (OPO) i samarbeid med nPOD for å gi forskningsressurser er oppført på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Takk til Dr. Kevin Otto, University of Florida, for å gi vibratomet som brukes til å generere museskiver.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Riferimenti
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
