Наблюдение за функцией островков и взаимодействием островковых и иммунных клеток в живых срезах ткани поджелудочной железы
Summary
В этом исследовании представлено применение живых срезов ткани поджелудочной железы для изучения физиологии островков и взаимодействия островковых и иммунных клеток.
Abstract
Живые срезы ткани поджелудочной железы позволяют изучать физиологию и функцию островков в контексте интактного микроокружения островка. Ломтики получают из живой ткани поджелудочной железы человека и мыши, встроенной в агарозу, и разрезают с помощью вибратома. Этот метод позволяет тканям поддерживать жизнеспособность и функцию в дополнение к сохранению основных патологий, таких как диабет 1 типа (T1D) и диабет 2 типа (T2D). Срезовый метод позволяет открыть новые направления в изучении поджелудочной железы через поддержание сложных структур и различных межклеточных взаимодействий, составляющих эндокринные и экзокринные ткани поджелудочной железы. Этот протокол демонстрирует, как выполнять окрашивание и покадровую микроскопию живых эндогенных иммунных клеток в срезах поджелудочной железы наряду с оценками физиологии островков. Кроме того, этот подход может быть усовершенствован для распознавания популяций иммунных клеток, специфичных для антигенов островковых клеток, с использованием основных комплексов гистосовместимости – мультимерных реагентов.
Introduction
Вовлечение поджелудочной железы патогномично для таких заболеваний, как панкреатит, СД1 и Т2Д1,2,3. Изучение функции изолированных островков обычно включает удаление островков из окружающей их среды4. Метод среза живой ткани поджелудочной железы был разработан для изучения ткани поджелудочной железы при сохранении неповрежденных микросред островков и избежании использования стрессовых процедур изоляции островков5,6,7. Срезы ткани поджелудочной железы из донорской ткани человека были успешно использованы для изучения СД1 и продемонстрировали процессы потери и дисфункции бета-клеток в дополнение к инфильтрации иммунных клеток8,9,10,11,12,13. Метод среза живой ткани поджелудочной железы может быть применен как к ткани поджелудочной железы мыши, так и к ткани поджелудочной железы человека5,6,8. Срезы ткани поджелудочной железы человека из донорских тканей органов получены в сотрудничестве с Сетью доноров органов поджелудочной железы с диабетом (nPOD). Мышиные срезы могут быть сгенерированы из множества различных штаммов мыши.
Этот протокол будет сосредоточен на не ожирении диабетически-рекомбинационной активации гена-1-null (NOD. Rag1-/-) и Т-клеточный рецептор трансгенный (AI4) (NOD. Раг1-/-. AI4 α/β) штаммы мыши. КИВОК. Мыши Rag1-/- не могут развивать Т- и В-клетки из-за нарушения в рекомбинационно-активирующем гене 1 (Rag1)14. КИВОК. Раг1-/-. Мыши AI4 α/β используются в качестве модели ускоренного диабета 1 типа, поскольку они производят один клон Т-клеток, который нацелен на эпитоп инсулина, что приводит к последовательной инфильтрации островков и быстрому развитию заболевания15. Протокол, представленный здесь, описывает процедуры функциональных и иммунологических исследований с использованием живых срезов поджелудочной железы человека и мыши с применением подходов конфокальной микроскопии. Методы, описанные в настоящем описании, включают оценку жизнеспособности, идентификацию и местоположение островков, цитозольные записи Ca2+, а также окрашивание и идентификацию популяций иммунных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью этого протокола является экспликация генерации срезов поджелудочной железы и процедур, необходимых для использования срезов в функциональных и иммунологических исследованиях. Есть много преимуществ использования живых ломтиков поджелудочной железы. Тем не менее, есть несколь…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась грантами NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 и P01 AI042288. Это исследование было проведено при поддержке Сети доноров органов поджелудочной железы с диабетом (nPOD; RRID: SCR_014641), совместный исследовательский проект по диабету 1 типа, спонсируемый JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) и благотворительным фондом Leona M. & Harry B. Helmsley (Grant #2018PG-T1D053). Содержание и высказанные мнения являются ответственностью авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения nPOD. Организации по закупке органов (OPO), сотрудничающие с nPOD для предоставления исследовательских ресурсов, перечислены в http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Спасибо доктору Кевину Отто из Университета Флориды за предоставление вибратома, используемого для генерации кусочков мыши.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
Riferimenti
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and analgesia in laboratory animals. , (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
