Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.
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Articolo metodologico
Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule Invariant Natural Killer T (iNKT) sono linfociti T innata che esprimono un recettore delle cellule T semi-invariante (TCR) conservato specifico per antigeni lipidici auto o microbici presentati dalla molecola non polimorfica MHC di classe I CD1d. Studi preclinici e clinici supportano un ruolo delle cellule iNKT nel cancro, nell'autoimmunità e nelle malattie infettive. Le cellule iNKT sono molto conservate in tutte le specie e la loro indagine è stata facilitata da modelli murini, tra cui topi cd1d-carenti o iNKT-carenti, e la possibilità di rilevarle inequivocabilmente in topi e uomini con tetrameri CD1d o mAbs specifici per il TCR semi-invariante. Tuttavia, le cellule iNKT sono rare e devono essere espanse per raggiungere numeri gestibili per qualsiasi studio. Poiché la generazione della linea cellulare iNKT di topo primario in vitro si è dimostrata difficile, abbiamo istituito un protocollo robusto per purificare ed espandere le cellule iNKT spleniche dai topi transgenici iVα14-Jα18 (iVα14Tg), in cui le cellule iNKT sono 30 volte più frequenti. Mostriamo qui che le cellule iNKT iVα14Tg miliniche primarie possono essere arricchite attraverso un processo di separazione immunomagnetica, producendo circa il 95-98% di cellule iNKT pure. Le cellule iNKT purificate sono stimolate da perline anti-CD3 / CD28 più IL-2 e IL-7, con conseguente espansione di 30 volte al giorno +14 della coltura con purezza dell'85-99%. Le cellule iNKT espanse possono essere facilmente manipolate geneticamente, fornendo uno strumento inestimabile per sezionare i meccanismi di attivazione e funzione in vitro e, soprattutto, anche dopo il trasferimento adottivo in vivo.
Introduzione
Le cellule T natural killer invarianti (cellule iNKT) sono linfociti T innati che esprimono un recettore semi-invariante delle cellule T αβ (TCR), formato nei topi da una catena Vα14-Jα18 invariante accoppiata con un insieme limitato di diverse catene Vβ1, che è specifico per gli antigeni lipidici presentati dalla molecola correlata alla classe I MHC CD1d2. Le cellule iNKT subiscono un programma di selezione agonista con conseguente acquisizione di un fenotipo effettore attivato/innato già presente nel timo, che avviene attraverso diversi stadi di maturazione3,4,....
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Protocollo
Le procedure qui descritte sono state esaminate e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) (n. 1048) dell'Istituto Scientifico San Raffaele.
NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. Tutti i reagenti utilizzati sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Lavorazione della milza
- Eutanasia dei topi iVα14-Jα18 per inalazione di CO2 secondo la politica istituzionale.
NOTA: i topi iVα14-Jα18 devono avere almeno 8 settimane. Per evitare il rigetto delle cellule dal trasferimento in vivo delle cellule, si consid....
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Risultati
Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di arricchire le cellule iNKT dalla milza di topi transgenici iVa14-Ja18 attraverso un processo di separazione immunomagnetica riassunto in Figura 1A. Le cellule T della milza totale vengono prima selezionate negativamente esaurendo le cellule B e i monociti, seguite dallo smistamento immunomagnetico positivo delle cellule iNKT con tetrameri CD1d caricati con antigene lipidico PBS-57, che consentono di colorare specificamente solo le cel.......
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Discussione
Qui mostriamo un protocollo riproducibile e fattibile per ottenere milioni di celle iNKT pronte all'uso. A causa della scarsità di queste cellule in vivo, era altamente necessario un metodo per espanderle. Il protocollo che proponiamo non richiede né una particolare strumentazione né un elevato numero di topi. Abbiamo sfruttato i topi transgenici iVα14-Jα18 di proposito per ridurre il numero di topi necessari per la procedura.
Un altro protocollo di successo per l'espansione cellulare iNKT da .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Paolo Dellabona e Giulia Casorati per il supporto scientifico e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche il NIH Tetramer Core Facility per il tetramero CD1d del topo. Lo studio è stato finanziato dalla Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (a M.F.) e dalla borsa di studio 2019-22604 dell'Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (a G.D.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di ammonio-cloruro-potassio (ACK) | in house | 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2-7,4 | |
| Microsfere anti-FITC | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| Microsfere anti-PE | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramero -PE | NIH tetramero core facility topo | PBS57-Cd1d-tetrameri | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| bloccante | Fc BD Bioscience | 553142 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Euroclone | ECS0186L | inattivato a caldo e filtrato .22 prima dell'uso |
| FOXP3 Tampone di colorazione del fattore di trascrizione | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomicina | Sigma | I0634 | |
| Colonne LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Colonne | LS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Tampone MACS (MB) | in house | 0,5% Albumina sierica bovina (BSA; Colonne Sigma-Aldrich) e 2Mm EDTA | |
| MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillina e streptomicina (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Tamponato con fosfato soluzione salina (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Filtri di Pre-Separazione (30 &; micro; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Topo ricombinato IL-7 | R& D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 con glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| piruvato di sodio | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| α CD3CD28 attivatore T per topi Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoetanolo | Gibco | 31350010 |
Riferimenti
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. The biology of NKT cells. Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. <....
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Ristampe e permessi
