Здесь описан недорогой, доступный протокол для оценки восстановления бабочек от холодового шока в условиях окружающей среды.
Экологическая физиология, особенно эктотерм, становится все более важной в этом меняющемся мире, поскольку она использует измерения видов и признаков окружающей среды для изучения взаимодействий между организмами и их окружением, чтобы лучше понять их выживание и приспособленность. Традиционные термические анализы являются дорогостоящими с точки зрения времени, денег и оборудования и поэтому часто ограничиваются небольшими размерами выборки и небольшим количеством видов. Здесь представлен новый протокол, который генерирует подробные данные об индивидуальном поведении и физиологии крупных, волантовых, наземных насекомых, на примере бабочек. В данной работе описаны методы анализа восстановления от холодового удара, которые могут быть выполнены в полевых условиях в условиях окружающей среды и не требуют дорогостоящего лабораторного оборудования. Этот метод был использован для понимания реакции и стратегии восстановления на холодный шок тропических бабочек, генерируя данные индивидуального уровня по целым сообществам бабочек. Эти методы могут использоваться как в отдаленных полевых условиях, так и в классных комнатах и могут использоваться для получения экологически значимых физиологических данных и в качестве учебного пособия.
Интеграция тепловой физиологии и экологии в конце 1970-х и начале 1980-х годов1,2 запустила область экологической физиологии. Обширные тепловые исследования, проведенные на эктотермах, подчеркивают эколого-физиологические синергии в различных эко-эволюционных контекстах3,4,5. Исследования по тепловой физиологии эктотермических организмов вновь обрели внимание в последнее время в условиях изменения климата и изменения тепловых ландшафтов во всем мире6,7. В дополнение к информированию исследований в академической области экологической физиологии, анализы тепловой физиологии могут быть широко доступны для исследователей и могут служить практическим подходом к обучению для всех уровней. Компоненты тепловых характеристик, включая тепловые пределы и последствия температурных шоков, имеют основополагающее значение для экологии, поведения и истории жизни животных8,9.
В частности, экототермы используются для решения вопросов физиологии, поскольку эндотермия диктует неразрывную связь между температурой окружающей среды и организма. Температурный диапазон, который могут выдержать организмы (от их критического теплового минимума до максимального теплового диапазона), и температуры, при которых их поведение и приспособленность максимизируются (тепловая оптима), часто коренятся в экологических и эволюционных процессах. Эти физиологические черты имеют все большее значение, поскольку температуры, как средние, так и экстремальные, увеличиваютсяна 10. Например, абиотические изменения, включая повышение температуры, которые сопровождают разрушение среды обитания и фрагментацию, затронули сообщества эктотерм, включая ануранов, ограничив физиологически хрупкие виды (с узкой тепловой толерантностью) небольшими остаточными участками средыобитания 11,12.
Оценка ключевых компонентов тепловых характеристик может быть дорогостоящей как с точки зрения времени, так и ресурсов и традиционно требует лабораторного оборудования и стандартизированных условий. Более того, обычные анализы часто не отражают широту условий окружающей среды, испытываемых в природе данным животным13, поскольку температура в аналогичных физиологических экспериментах тщательно контролируется и часто не связана с условиями окружающей среды, испытываемыми животным. Этот контроль температуры может уменьшить понимание вариаций в отдельных реакциях2,14. Физиологи полагались на лабораторные эксперименты по нагреванию и охлаждению, используя программируемые водяные бани для устойчивого нагрева или охлаждения окружающей среды животного для информирования кривых тепловых характеристик15.
Как правило, животных помещают во флаконы с термопарой, и температура их окружающей среды постоянно изменяется путем контроля температуры окружающей водяной бани. Исследователи измеряют время, необходимое для достижения измененного физиологического состояния (например, холодная кома, нокдаун) и температуру, при которой произошло изменение статуса16,17. Начиная с минимума в 500 долларов США, эти инструменты являются большими, тяжелыми и требуют дополнительного технического оборудования (например, компьютер, термопары). Следовательно, основными инструментами для проведения классических методов оценки тепловых характеристик являются: 1) экономически недоступные для всех, 2) не пригодные для анализа животных, слишком большие, чтобы содержаться в обычных флаконах, используемых для небольших диптеранов, и 3) не портативные для использования в отдаленных полевых условиях. Следование общепринятой практике привело к ограниченному представительству в таксономии и экспериментальных условиях18,19,20.
В то время как полные кривые тепловых характеристик могут информировать о распределении видов, признаках истории жизни и поведении, среди других признаков, количественная оценка меньшего количества и более простых тепловых показателей может быть более эффективной и все же чрезвычайно информативной. Физиологические анализы, измеряющие начало холодовой комы и последующее восстановление холодового шока, холодостойку и выпрямляющее поведение, являются эффективными и исполняемыми прокси для критического теплового минимума организма8. Здесь описан анализ холодного шока, полезный для получения физиологических данных от крупных наземных эктотермических насекомых. Анализ является недорогим, доступным и простым в выполнении в полевых условиях или в классе. Данные о восстановлении после холодового шока, генерируемые этим протоколом, могут быть объединены с данными о видах или признаках индивидуального уровня для изучения вопросов, касающихся экологической физиологии, и / или использоваться для обучения студентов физиологическим принципам.
Изучение тепловой физиологии включает в себя измерения видов и признаков окружающей среды, чтобы лучше понять взаимодействия между организмами и их окружением, которые являются ключом к выживанию и приспособленности. Хотя тепловые черты всегда являются неотъемлемой частью понимания естественной истории и экологии растений и животных, они имеют все большее значение перед лицом ландшафта и изменения климата11,21. Несколько групп эктотермических наземных насекомых, в частности, чешуекрылых и одонатанов, относительно велики и многочисленны, демонстрируют различное поведение и поддаются манипуляциям. Здесь описан эффективный и недорогой анализ для эффективного измерения физиологических реакций таких насекомых. Этот протокол требует источника здоровых организмов для анализа, время обработки которых до эксперимента ограничено. Несмотря на гибкость в отношении числа организмов, анализируемых за один раз, число фокусных особей в одном эксперименте будет варьироваться в зависимости от цели сбора данных и/или числа наблюдателей.
Например, этот протокол был разработан для сбора подробных индивидуальных данных о бабочах в целых сообществах. Таким образом, репрезентативные результаты иллюстрируют усилия по максимальному сбору данных по отдельным особям как можно большего количества видов и при различных условиях, имеющих отношение к местной окружающей среде. Независимо от количества очаговых видов, для наблюдателя крайне важно иметь возможность идентифицировать каждую особь в клетке, переживающую выздоровление. Если цель состоит в том, чтобы собрать данные только от одного вида, то только одна или две особи (если они идентифицируются на основе разного износа крыльев или если они индивидуально отмечены) должны быть сразу же анализированы. Предметы исследования должны быть выбраны в соответствии с конкретным исследовательским вопросом или планом обучения. В зависимости от поставленного вопроса и цели сбора данных (например, исследования или классной комнаты), размер выборки и сбор других признаков будут различаться.
Чтобы проиллюстрировать фундаментальные компоненты физиологии, проясняемые этим протоколом (индукция холодовой комы, этапы восстановления, роль условий окружающей среды), преподаватель в классе может выбрать два различных вида или морфы одного вида. Если очаговые особи отличаются только одним ключевым признаком (например, цветом), потребуется меньший размер выборки, и студенты могут внимательно изучить взаимосвязь этого признака и физиологии организма. Исследователи, интересующиеся экологической физиологией, могут использовать свои экспериментальные данные для изучения сложных экологических и эволюционных вопросов. Исследователи должны быть уверены, что тщательно выбирают очаговых насекомых, которые непосредственно решают их вопросы (например, на основе стадии жизни, возраста, пола, местоположения), и, основываясь на количестве вовлеченных переменных, определяют соответствующий размер выборки. Размеры выборки для сложных моделей будут больше, чем описанные выше.
При сборе данных о поведенческом восстановлении важно, чтобы клетка лежала над землей, потому что наблюдатель должен быть в состоянии постучать по дну клетки, чтобы вызвать поведение восстановления. Это гарантирует, что организм реагирует (стоит, летает), как только он физиологически способен это сделать, и поведение терминального восстановления (полет) документируется. Регистрация условий окружающей среды во время восстановления после холодового шока является неотъемлемой частью изучения физиологии тепла, поскольку этот протокол предназначен для изучения и распутывать роль окружающей среды в физиологии организма. Регистраторы данных (см. Таблицу материалов)полезны для записи стандартизированных показателей соответствующих условий (например, температуры, света и даже влажности). Однако, если эти инструменты недоступны, соответствующие условия могут быть измерены другими способами, такими как цифровой термометр или путем упрощения переменной условий окружающей среды и использования различных сред, таких как тень и солнце. Этот протокол дает исследователю возможность измерить условия во время восстановления после холодного шока на основе цели и объема исследования.
Хотя этот метод может быть модифицирован, чтобы лучше соответствовать конкретным таксономическим группам, рекомендуется использовать крупных, волюновых насекомых. Летающие насекомые, которые восстанавливают свою способность летать самостоятельно, можно считать достигающими полного выздоровления. Метод, как описано, успешно применялся на бабочках в тропиках и субтропиках. Основываясь на тепловых тенденциях данной области (т.е. диапазоне температур, испытываемых на участке, который будет варьироваться, тем самым влияя на ожидания, основанные на высоте, широте, покрытии полога), организму может потребоваться более или менее одного часа на ледяной водяной бане, чтобы войти в холодную кому. Размер организма также может влиять на время, необходимое для вступления в холодную кому. Это ключ к тому, чтобы найти время воздействия холода, необходимое для того, чтобы вызвать холодную кому (не двигаясь), но не убить очаговые виды. Время, необходимое для того, чтобы вызвать холодную кому, будет зависеть от размера, местоположения и естественной истории / поведения людей. Основываясь на результатах эксперимента с холодным шоком, описанного в настоящем документе, и используя знания об экологии очаговых насекомых, выберите время, в которое следует завершить испытание, если данный человек не выздоровеет полностью.
Основываясь на конкретных вопросах исследователя, этот метод может быть использован либо в полевых условиях, либо в лаборатории, чтобы обеспечить как естественную изменчивость окружающей среды, так и контроль важных переменных, соответственно. Этот анализ прост и недорог и помогает заполнить существующие пробелы в области физиологии тепла. Простота этого протокола делает его доступным для использования для разнообразного массива таксонов, открывая поле для большего, чем лабораторные организмы. Новизна выполнения стандартизированного, но окружающего теплового анализа заполняет пробел между лабораторными и полевыми результатами22. Использование условий окружающей среды для восстановления организма поможет исследователям разделить роль факторов окружающей среды и вида в физиологии14,22. Наконец, из-за его низкой стоимости и отсутствия необходимых материалов, этот протокол может использоваться в отдаленных местах в полевых условиях с небольшим количеством оборудования – идеально подходит для многих полевых биологов – а также в классах, чтобы позволить молодым студентам получить практический опыт обучения.
The authors have nothing to disclose.
Спасибо Джарету Дэниелсу, Изабелле Пламмер, Бретту Шефферу и Дэну Хану за вклад в протокол, когда он был впервые разработан. Дополнительная благодарность Хайме Хаггарду, Себастьяну Дюрану и Индиане Кристобалю Ройсу-Малаверу за реализацию нескольких итераций этого протокола и за вклад в ключевые компоненты. Спасибо также анонимному рецензенту за отзыв о рукописи в целом. Поддержка была оказана издательским фондом Центра Чешуекрылых и биоразнообразия Макгуайра, Колледжем сельскохозяйственных и биологических наук, Школой природных ресурсов и окружающей среды и отделом экологии и сохранения дикой природы в UF.
24 x 24 x 36" Popup Rearing & Observation Cage | Bioquip | 1466PB | Ensure that the cage is slightly elevated from the ground to be able to tap the floor of the cage during experiments. |
Cooler | Any | NA | |
Glassine envelopes | Bioquip | 1130B | |
HOBO Pendant Temperature/Light 8K Data Logger | Onset | UA-002-08 | If a datalogger is not accessible, researchers may choose to use a digital thermometer to record ambient temperatures at regular intervals. See protocol step 4.5 for additional information. |
HOBO Optic USB Base Station | Onset | Base-U-1 | |
Ice water | NA | NA | |
Insects (focal taxa) | NA | Any | Collect sufficient samples to test, ensuring replication of experimental groups (e.g. species, sampling location) |
PVC T-joint | Any | Any | |
Sealable plastic bag | Any | NA | |
Stopwatch/timer | Any | NA | |
Weight | Any | NA | Large coins or small rocks to weigh down the plastic bags will ensure that specimens are submerged in ice water. A standardized weight is ideal. |