Dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af antistoffer fra samme art til at studere Host-Patogen interaktioner

Summary

Her beskriver protokollen, hvordan man udfører dobbelt mærkning immunofluorescence ved hjælp af primære antistoffer rejst i samme art for at studere værtspatogeninteraktioner. Det kan også omfatte det tredje antistof fra en anden vært i denne protokol. Denne tilgang kan foretages i enhver celletype og patogener.

Abstract

I dag er det muligt at finde en bred vifte af molekylære værktøjer til rådighed til at studere parasit-værtscelleinteraktioner. Der er dog nogle begrænsninger for at opnå kommercielle monoklonale eller polyklonale antistoffer, der genkender specifikke cellestrukturer og proteiner i parasitter. Desuden er der få kommercielle antistoffer til rådighed til at mærke trypanosomatider. Normalt fremstilles polyklonale antistoffer mod parasitter internt og kan være mere udfordrende at bruge i kombination med andre antistoffer, der produceres i samme art. Her viser protokollen, hvordan man bruger polyklonale og monoklonale antistoffer rejst i samme art til at udføre dobbelt mærkning immunofluorescence at studere værtscelle og patogen interaktioner. For at opnå dobbelt mærkning immunofluorescence, er det afgørende at inkubere først musen polyklonale antistof og derefter følge inkubationen med den sekundære mus IgG antistof konjugeret til fluorochrome. Derefter er et ekstra blokeringstrin nødvendigt for at forhindre, at ethvert spor af det primære antistof genkendes af det næste sekundære antistof. Derefter tilsættes et musemonolonalt antistof og dets specifikke IgG subklasse sekundære antistof, der er konjugeret til et andet fluorkrom, til prøven på de relevante tidspunkter. Derudover er det muligt at udføre tredobbelt mærkning immunfluorescence ved hjælp af et tredje antistof rejst i en anden art. Også strukturer som kerner og actin kan farves efterfølgende med deres specifikke forbindelser eller etiketter. Således kan disse tilgange, der præsenteres her, justeres for enhver celle, hvis kilder til primære antistoffer er begrænsede.

Introduction

At studere samspillet mellem patogenet med værtscellen på celleniveau giver vigtige oplysninger om de underliggende årsager til sygdommen, da forskellige grupper, såsom vira, bakterier og protozoer, kan inficere de fleste værtscelletyper1,2,3,4. Det kan også hjælpe med at udvikle og identificere potentielle terapeutiske mål, der kan bremse eller hæmme væksten af patogenet. Under levende forhold er de producerede antistoffer ansvarlige for at genkende selvkomponenter, antigener fra vira, bakteriekomponenter eller produkter, svampe, parasitter og ^andre5.

Til dette formål er antistoffer meget anvendte værktøjer, hovedsagelig til at forstå placeringen og funktionen af cellulære strukturer og proteiner. Flere undersøgelser ved hjælp af flere antistofmærkninger viser, at yderligere blokeringstrin bidrager til immunolokaliseringens specificitet. Derudover bruger de fleste beskrevne protokoller specifikke kommercielle monoklonale antistoffer, herunder antistoffer fra samme værtsart6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Normalt bruger dobbelt mærkning immunofluorescence to antistoffer rejst i forskellige arter til at plette cellestrukturerne af interesse eller patogenerne og værtscellerne for at se samspillet mellem dem. Dette kan dog være et problem, når der ikke er nogen kommercielle monoklonale eller polyklonale antistoffer, der er specifikke for nogle patogener, til rådighed til at udføre dobbeltmærkningen. Der er også kommercielt tilgængelige antistofbøjningssæt, og det er muligt at konjugere de primære antistoffer direkte til fluorophoren ved en kortfattet ^{esterreaktion15}. Problemet er, at disse kits ofte er dyre, og det er nødvendigt at have nok antistoffer til at mærke dem. Ved at vide dette udviklede vi med succes en dobbelt immunfluorescencemetode ved hjælp af to forskellige antistoffer rejst i samme art for at studere protein localization i Trypanosoma brucei16. Men for intracellulære parasitter, herunder Trypanosoma cruzi, er denne tilgang ikke blevet påvist. Her viser vi, hvordan man udfører dobbelt mærkning immunfluorescence at studere intracellulære T. cruzi parasitter og værtscellen ved hjælp af primære antistoffer rejst i samme art uden krydsreaktioner. Ud over denne metode er der etableret en tredobbelt immunofluorescencemærkning med tilsætning af det tredje antistof fra en anden art. Disse tilgange hjælper, når kilden til antistoffer er begrænset og kan bruges i enhver celletype.

Protocol

1. Celle- og parasitkulturer Grow LLC-MK2 (Rhesus Monkey Kidney Epithelial) celler fra American Type Culture Collection (CCL-7) i en 25 cm2 cellekultur kolbe indeholdende i RPMI medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS (Fosterkvæg Serum) og antibiotika (100 U / mL Penicillin og 100 μg / mL Streptomycin) ved 37 °C i 5% CO2 17. Inficere LLC-MK2 celler med Trypanosoma cruzi (Y stamme) i henhold til en tidligere protokol 18</…

Representative Results

Her viser vi, hvordan man studerer værtsparasitinteraktioner ved immunfluorescence, når kilden til antistoffer er begrænset på grund af manglende adgang til kommercielle antistoffer, der genkender specifikke strukturer og proteiner i trypanosomatider. Blandt trypanosomatider har T. cruzi en af de mest komplekse livscyklusser, der involverer forskellige udviklingsstadier mellem hvirveldyr og hvirvelløse værter 19. Under T. cruzi livscyklus, på et…

Discussion

Her præsenterer vi en protokol til at udføre dobbelt immunmærkning i Trypanosoma cruzi inficerede celler ved hjælp af to forskellige antistoffer fra samme værtsart. For at studere, med flere detaljer, konsekvenserne af infektionen, strukturer i værtscellen såsom kernen eller cytosolic organeller kan mærkes ved hjælp af denne protokol. Det kan også bruges i den post-integrering af tynde sektion immunogold mærkning metode. Denne tilgang hjælper med at overvinde forhindringen for at have få antistoffer…

Materials

Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody	Life technologies, USA	A21141	Goat anti-mouse
AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch, USA	315-005-003	Anti-mouse antibody
Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A11017	Goat anti mouse
Alexa Fluor 594 IgG1 antibody	Life technologies, USA	A21125	Goat anti-mouse
Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody	Life technologies, USA	A21237	Goat anti-mouse
Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b	Sigma-Aldrich, USA	R4528	Mouse antibody
anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody	Our lab	In-house	Mouse antibody
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A2153-10G	Albumin protein
Detergent Igepal CA-630	Sigma-Aldrich, USA	I3021	Nonionic Detergent
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	12657-029	Serum
Penicillin Streptomycin	Gibco, Thermo fisher scientific, USA	15140-122	Antibiotic
Phalloidin Alexa Fluor 594	Life technologies, USA	A12381	Actin marker
ProLong Gold antifade with DAPI	Life technologies, USA	P36935	Mounting media reagent
RPMI 1640 1X with L-glutamine	Corning, USA	10-040-CV	Cell culture media
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich, USA	T4049-100ML	Bioreagent