Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.
Exosomen uitgescheiden door mesenchymale stamcellen (MSC’s) zijn gesuggereerd als veelbelovende kandidaten voor kraakbeenletsels en artrosebehandeling. Exosomen voor klinische toepassing vereisen grootschalige productie. Daartoe werden menselijke synoviale vloeistof-MSC’s (hSF-MSC’s) gekweekt op microcarrierparels en vervolgens gekweekt in een dynamisch driedimensionaal (3D) kweeksysteem. Door gebruik te maken van 3D dynamische cultuur, heeft dit protocol met succes grootschalige exosomen verkregen uit SF-MSC-cultuursupernatanten. Exosomen werden geoogst door ultracentrifugatie en geverifieerd door een transmissie-elektronenmicroscoop, nanodeeltjestransmissietest en western blotting. Ook werd de microbiologische veiligheid van exosomen gedetecteerd. Resultaten van exosoomdetectie suggereren dat deze aanpak een groot aantal good manufacturing practices (GMP)-grade exosomen kan produceren. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artrosebehandeling.
Artrose (OA), als gevolg van gewrichtskraakbeen en onderliggende botafbraak, blijft een ernstige uitdaging die leidt tot invaliditeit 1,2. Zonder bloed- en zenuwtoevoer is het zelfgenezend vermogen van kraakbeen minimaal als het eenmaal gewond isgeraakt 3,4. In de afgelopen decennia hebben therapieën op basis van autologe chondrocytenimplantatie (ACI) enige vooruitgang geboekt bij de behandeling van artrose5. Voor chondrocytenisolatie en -uitbreiding is het oogsten van klein kraakbeen uit het niet-gewichtdragende gebied van het OA-gewricht noodzakelijk, waardoor verwondingen aan het kraakbeen ontstaan. Ook vereist de procedure een tweede operatie om de uitgebreide chondrocyten te implanteren6. Zo worden eenstapstherapieën voor artrosebehandeling zonder kraakbeenletsels uitgebreid onderzocht.
Mesenchymale stamcellen (MSC’s) zijn voorgesteld als veelbelovende alternatieven voor behandeling met artrose 7,8. Afkomstig van meerdere weefsels, kunnen MSC’s differentiëren in chondrocyten met specifieke stimulatie. Belangrijk is dat MSC’s immuunresponsen kunnen moduleren via anti-ontsteking9. Daarom hebben MSC’s aanzienlijke voordelen bij de behandeling van artrose door kraakbeendefecten te repareren en de immuunrespons te moduleren, vooral in het ontstekingsmilieu. Voor de behandeling van artrose hebben MSC’s uit synoviale vloeistof (SF-MSC’s) onlangs veel aandacht getrokken vanwege hun sterkere chondrocytendifferentiatievermogen dan andere MSC-bronnen10,11. Met name in de orthopedische kliniek is de extractie van inflammatoire SF uit de gewrichtsholte een routinetherapie om het pijnsymptoom van OA-patiënten te verlichten. Geëxtraheerde inflammatoire SF wordt meestal weggegooid als medisch afval. Zowel patiënten als artsen zijn klaar om autologe MSC’s geïsoleerd uit de inflammatoire SF te beschouwen als OA-behandeling met zeer weinig ethische conflicten. SF-MSC-therapie is echter gecompromitteerd als gevolg van tumorogene risico’s, langdurige opslag en verre verzendbarrières.
Exosomen, uitgescheiden door vele celtypen, waaronder MSC’s, dragen het grootste deel van de bio-informatie van de moedercel. Het is diepgaand onderzocht als een celvrije therapie12,13. Volgens de bijgewerkte bronnen die beschikbaar zijn op de website van de overheid van klinische studies (ClinicalTrials.gov), worden uitgebreidere exosoom klinische studies geïnitieerd en uitgevoerd op het gebied van kanker, hypertensie en neurodegeneratieve ziekten. SF-MSC exosoombehandeling kan een spannende en uitdagende studie zijn om met artrose om te gaan. Good manufacturing practice (GMP)-grade en grootschalige exosoomproductie zijn essentieel voor klinische vertaling. Kleinschalige exosoomisolatie is op grote schaal uitgevoerd op basis van tweedimensionale (2D) celcultuur. Grootschalige exosoomproductiestrategieën moeten echter worden geoptimaliseerd. In deze studie werd een grootschalige productiemethode voor exosomen ontwikkeld, gebaseerd op massale SF-MSC-cultuur in xenovrije omstandigheden. Na ultracentrifugatie van celkweeksupernatanten werden de veiligheid en functie van exosoom gevalideerd.
De mesenchymale stamcellen zijn op grote schaal gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun zelfvernieuwing, gedifferentieerd tot weefselcellen met gespecialiseerde functies en paracriene effecten16,17. Met name de paracriene effecten van exosomen hebben veel aandacht getrokken18. Exosomen dragen de bio-informatie van MSC’s en vervullen hun biologische functie en overwinnen MSC-tekortkomingen, zoals problematische opslag en verzen…
The authors have nothing to disclose.
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Key Program of Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong Internationaal Samenwerkingsproject (Nr.2021A0505030011); Shenzhen Wetenschaps- en Technologieprojecten (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (Nr.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr.2021A1515010985); Sanming Project van Geneeskunde in Shenzhen (SZSM201612079); Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong.
BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
TEM | JEM-1200EX | ||
The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |