כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי.
אקסוזומים המופרשים על ידי תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כמועמדים מבטיחים לפגיעות סחוס ולטיפול באוסטאוארתריטיס. אקסוזומים ליישום קליני דורשים ייצור בקנה מידה גדול. למטרה זו, MSCs של נוזל סינוביאלי אנושי (hSF-MSCs) גודלו על חרוזי מיקרו-קריין, ולאחר מכן גודלו בתרבית במערכת תרבותית דינמית תלת-ממדית (3D). באמצעות שימוש בתרבית דינמית תלת-ממדית, פרוטוקול זה השיג בהצלחה אקסוזומים בקנה מידה גדול מסופרנאטנטים של תרבית SF-MSC. אקסוזומים נקטפו על ידי אולטרה-צנטריפוגציה ואומתו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים משודר, בדיקת העברת ננו-חלקיקים וכתם מערבי. כמו כן, זוהתה הבטיחות המיקרוביולוגית של אקסוזומים. תוצאות של זיהוי אקסוזומים מצביעות על כך שגישה זו יכולה לייצר מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים). אקסוזומים אלה יכולים לשמש במחקר בביולוגיה של אקסוזומים ובטיפול קליני באוסטאוארתריטיס.
דלקת מפרקים ניוונית (OA), הנובעת מסחוס המפרקים ומפירוק העצם הבסיסי, נותרה אתגר חמור המוביל לנכות 1,2. ללא אספקת דם ועצבים, יכולת הריפוי העצמי של הסחוס היא מינימלית לאחר שנפצע 3,4. בעשורים האחרונים, טיפולים המבוססים על השתלת כונדרוציטים אוטולוגית (ACI) התקדמו מעט בטיפול OA5. עבור בידוד והרחבה של כונדרוציטים, יש צורך בקצירת סחוס קטן מהאזור שאינו נושא משקל של מפרק ה-OA, מה שגורם לפציעות בסחוס. כמו כן, ההליך ידרוש פעולה שנייה להשתלת הכונדרוציטים המורחבים6. לפיכך, טיפולים חד-שלביים לטיפול ב-OA ללא פגיעות סחוס נמצאים תחת חקירה מקיפה.
תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כחלופות מבטיחות לטיפול ב-OA 7,8. MSCs, שמקורם ברקמות מרובות, יכולים להתמיין לכונדרוציטים עם גירוי ספציפי. חשוב לציין כי MSCs יכולים לווסת את התגובה החיסונית באמצעות נוגדי דלקת9. לכן, ל-MSCs יש יתרונות משמעותיים בטיפול ב-OA על ידי תיקון פגמים בסחוס וויסות התגובה החיסונית, במיוחד בסביבה הדלקתית. עבור טיפול OA, MSCs מנוזל סינוביאלי (SF-MSCs) משכו לאחרונה תשומת לב רבה בשל יכולת ההתמיינות החזקה יותר שלהם בכונדרוציטים בהשוואה למקורות MSCאחרים 10,11. יש לציין כי במרפאה האורתופדית, מיצוי SF דלקתי מחלל המפרק הוא טיפול שגרתי להקלה על תסמין הכאב של חולי OA. SF דלקתי מופק בדרך כלל מושלך כפסולת רפואית. הן המטופלים והן הרופאים מוכנים לשקול MSCs אוטולוגיים שבודדו מה- SF הדלקתי כטיפול OA עם מעט מאוד קונפליקטים אתיים. עם זאת, טיפול SF-MSC נפגע עקב סיכונים סרטניים, אחסון ארוך ומחסומי משלוח מרוחקים.
אקסוזומים, המופרשים על ידי סוגי תאים רבים, כולל MSCs, נושאים את רוב המידע הביולוגי של תא האב. הוא נחקר לעומק כטיפול ללא תאים12,13. על פי המשאבים המעודכנים הזמינים באתר ממשלת הניסויים הקליניים (ClinicalTrials.gov), מחקרים קליניים מקיפים יותר של אקסוזומים יוזמים ומתבצעים בתחומי המחקר של סרטן, יתר לחץ דם ומחלות נוירו-ניווניות. טיפול באקסוזום SF-MSC יכול להיות ניסוי מרגש ומאתגר להתמודדות עם OA. תנאי ייצור נאותים (GMP) וייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול חיוניים לתרגום קליני. בידוד אקסוזומים בקנה מידה קטן בוצע באופן נרחב על בסיס תרבית תאים דו-ממדית (2D). עם זאת, אסטרטגיות ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול זקוקות לאופטימיזציה. במחקר זה פותחה שיטת ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול, המבוססת על תרבית SF-MSC מסיבית בתנאים נטולי קסנו. לאחר אולטרה-צנטריפוגה מתרביות-על של תרביות תאים, הבטיחות והתפקוד של האקסוזומים אומתו.
תאי הגזע המזנכימליים נמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית בשל ההתחדשות העצמית שלהם, התמיינות לתאי רקמה עם פונקציות מיוחדות, ואפקטים פרקריניים16,17. יש לציין כי ההשפעות הפראקריניות המופעלות על ידי אקסוזומים משכו תשומת לב רבה18. אקסוזומים נושאים א?…
The authors have nothing to disclose.
הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘81972116, מס’ 81972085, מס’ 81772394); תוכנית המפתח של הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מס ‘2018B0303110003); פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי של גואנגדונג (מס ‘2021A0505030011); שנזן פרויקטים של מדע וטכנולוגיה (לא. GJHZ20200731095606019, לא. JCYJ20170817172023838, לא. JCYJ20170306092215436, לא. JCYJ20170413161649437); קרן סין למדע בתר-דוקטוריאלי (No.2020M682907); קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (No.2021A1515010985); פרויקט סאנמינג לרפואה בשנג’ן (SZSM201612079); כספים מיוחדים לבניית בתי חולים ברמה גבוהה במחוז גואנגדונג.
BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
TEM | JEM-1200EX | ||
The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |