Storskala fremstilling av synovialvæske mesenkymale stamcelleavledede eksosomer ved 3D bioreaktorkultur
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å produsere et stort antall GMP-klasse eksosomer fra synovialvæske mesenkymale stamceller ved hjelp av en 3D-bioreaktor.
Abstract
Exosomer utskilt av mesenkymale stamceller (MSCs) har blitt foreslått som lovende kandidater for bruskskader og slitasjegiktbehandling. Exosomer for klinisk anvendelse krever storskala produksjon. Til dette formål ble humane synovialvæske MSCs (hSF-MSCs) dyrket på mikrobærerperler, og deretter dyrket i et dynamisk tredimensjons (3D) kultursystem. Gjennom å bruke 3D-dynamisk kultur, oppnådde denne protokollen vellykket storskala eksosomer fra SF-MSC-kultursupernatanter. Eksosomer ble høstet ved ultracentrifugering og verifisert av et transmisjonselektronmikroskop, nanopartikkeloverføringsanalyse og vestlig blotting. Også den mikrobiologiske sikkerheten til eksosomer ble detektert. Resultater av eksosomdeteksjon antyder at denne tilnærmingen kan produsere et stort antall eksosomer av god produksjonspraksis (GMP). Disse eksosomene kan brukes i eksosombiologiforskning og klinisk slitasjegiktbehandling.
Introduction
Artrose (OA), som følge av leddbrusk og underliggende beinbrudd, er fortsatt en alvorlig utfordring som fører til uførhet 1,2. Uten blod- og nerveforsyning er brusk selvhelbredende evne minimal når den først ble skadet 3,4. I de siste tiårene har terapier basert på autolog kondrocyttimplantasjon (ACI) gjort noen fremskritt i OA-behandling5. For kondrocyttisolasjon og ekspansjon er høsting av liten brusk fra OA-leddets ikke-vektbærende område nødvendig, noe som forårsaker skader på brusk. Prosedyren vil også kreve en annen operasjon for å implantere de utvidede kondrocyttene6. Dermed er ett-trinns terapier for OA-behandling uten bruskskader under omfattende leting.
Mesenkymale stamceller (MSCs) har blitt foreslått som lovende alternativer for OA-behandling 7,8. Stammer fra flere vev, kan MSCs differensiere i kondrocytter med spesifikk stimulering. Det er viktig at MSCs kan modulere immunresponser via antiinflammasjon9. Derfor har MSCs betydelige fordeler i OA-behandling ved å reparere bruskdefekter og modulere immunresponsen, spesielt i betennelsesmiljøet. For OA-behandling har MSC fra synovialvæske (SF-MSCs) nylig fått mye oppmerksomhet på grunn av deres sterkere kondrocyttdifferensieringsevne enn andre MSC-kilder10,11. Spesielt på ortopedisk klinikk er ekstraksjonen av inflammatorisk SF fra felleshulen en rutinemessig terapi for å lindre smerte symptomet hos OA-pasienter. Ekstrahert inflammatorisk SF kastes vanligvis som medisinsk avfall. Både pasienter og leger er klare til å vurdere autolog MSC isolert fra inflammatorisk SF som OA-behandling med svært få etiske konflikter. Imidlertid er SF-MSC-terapi kompromittert på grunn av tumorigen risiko, langvarig lagring og fjerne forsendelsesbarrierer.
Eksosomer, utskilt av mange celletyper, inkludert MSCs, bærer det meste av foreldrecellens bioinformasjon. Det har blitt undersøkt i dybden som en cellefri terapi12,13. I følge de oppdaterte ressursene som er tilgjengelige på nettstedet til Clinical Trial Government (ClinicalTrials.gov), blir mer omfattende eksosomkliniske studier initiert og gjennomført innen forskningsfeltene kreft, hypertensjon og nevrodegenerative sykdommer. SF-MSC eksosombehandling kan være en spennende og utfordrende studie for å takle OA. God produksjonspraksis (GMP)-grad og storskala eksosomproduksjon er avgjørende for klinisk oversettelse. Småskala eksosomisolasjon har blitt mye utført basert på todimensjonal (2D) cellekultur. Imidlertid trenger store eksosomproduksjonsstrategier optimalisering. En storskala eksosomproduksjonsmetode ble utviklet i denne studien, basert på massiv SF-MSC-kultur under xenofrie forhold. Etter ultrasentrifugering fra cellekultursupernatanter ble eksosom sikkerhet og funksjon validert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesenkymale stamceller har blitt mye brukt i regenerativ medisin på grunn av deres selvfornyelse, differensiert i vevsceller med spesialiserte funksjoner, og parakrine effekter16,17. Spesielt har de parakrine effektene som utøves av eksosomer tiltrukket seg mye oppmerksomhet18. Eksosomer bærer bioinformasjonen til MSC-er og utfører sin biologiske funksjon og overvinner MSC-mangler, for eksempel plagsom lagring og forsendelse. Dermed ha…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Nøkkelprogram for naturvitenskapsstiftelsen i Guangdong-provinsen (nr. 2018B0303110003); Guangdong internasjonale samarbeidsprosjekt (nr.2021A0505030011); Shenzhen vitenskaps- og teknologiprosjekter (nr. GJHZ20200731095606019, nr. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kina Postdoctoral Science Foundation (No.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr.2021A1515010985); Sanming Prosjekt for medisin i Shenzhen (SZSM201612079); Spesielle midler til bygging av sykehus på høyt nivå i Guangdong-provinsen.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
Riferimenti
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -. J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
