Storskalig beredning av synovialvätska mesenkymala stamcellsderiverade exosomer genom 3D-bioreaktorodling
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att producera ett stort antal exosomer av GMP-kvalitet från synovialvätska mesenkymala stamceller med hjälp av en 3D-bioreaktor.
Abstract
Exosomer som utsöndras av mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande kandidater för broskskador och artrosbehandling. Exosomer för klinisk tillämpning kräver storskalig produktion. För detta ändamål odlades humana synovialvätska MSC (hSF-MSC) på mikrobärarpärlor och odlades sedan i ett dynamiskt tredimensionellt (3D) odlingssystem. Genom att använda 3D-dynamisk kultur erhöll detta protokoll framgångsrikt storskaliga exosomer från SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer skördades genom ultracentrifugering och verifierades av ett transmissionselektronmikroskop, nanopartikelöverföringsanalys och western blotting. Dessutom detekterades den mikrobiologiska säkerheten hos exosomer. Resultat av exosomdetektering tyder på att den här metoden kan producera ett stort antal exosomer av god tillverkningssed (GMP). Dessa exosomer kan användas i exosombiologisk forskning och klinisk artrosbehandling.
Introduction
Artros (OA), till följd av ledbrosk och underliggande bennedbrytning, är fortfarande en allvarlig utmaning som leder till funktionshinder 1,2. Utan blod- och nervtillförsel är broskets självläkande förmåga minimal när den väl har skadats 3,4. Under de senaste decennierna har terapier baserade på autolog kondrocytimplantation (ACI) gjort vissa framsteg i OA-behandling5. För kondrocytisolering och expansion är det nödvändigt att skörda litet brosk från OA-ledens icke-viktbärande område, vilket orsakar skador på brosket. Förfarandet kommer också att kräva en andra operation för att implantera de expanderade kondrocyterna6. Således är enstegsterapier för OA-behandling utan broskskador under omfattande utforskning.
Mesenkymala stamceller (MSC) har föreslagits som lovande alternativ för OA-behandling 7,8. MSC kommer från flera vävnader och kan differentieras till kondrocyter med specifik stimulering. Viktigt är att MSC kan modulera immunsvar via anti-inflammation9. Därför har MSC betydande fördelar vid OA-behandling genom att reparera broskdefekter och modulera immunsvaret, särskilt i inflammationsmiljön. För OA-behandling har MSC från synovialvätska (SF-MSC) nyligen väckt stor uppmärksamhet på grund av deras starkare kondrocytdifferentieringsförmåga än andra MSC-källor10,11. I synnerhet på den ortopediska kliniken är extraktionen av inflammatorisk SF från ledhålan en rutinbehandling för att lindra smärtsymptomet hos OA-patienter. Extraherad inflammatorisk SF bortskaffas vanligtvis som medicinskt avfall. Både patienter och läkare är redo att överväga autologa MSC isolerade från inflammatorisk SF som OA-behandling med mycket få etiska konflikter. SF-MSC-terapi äventyras dock på grund av tumörogena risker, långvarig lagring och avlägsna leveransbarriärer.
Exosomer, som utsöndras av många celltyper, inklusive MSC, bär det mesta av modercellens bioinformation. Det har undersökts ingående som en cellfri terapi12,13. Enligt de uppdaterade resurserna som finns tillgängliga på webbplatsen för kliniska prövningar (ClinicalTrials.gov) initieras och genomförs mer omfattande exosomkliniska studier inom forskningsområdena cancer, högt blodtryck och neurodegenerativa sjukdomar. SF-MSC exosombehandling kan vara en spännande och utmanande prövning för att hantera OA. God tillverkningssed (GMP) och storskalig exosomproduktion är avgörande för klinisk översättning. Småskalig exosomisolering har utförts i stor utsträckning baserat på tvådimensionell (2D) cellodling. Storskaliga exosomproduktionsstrategier behöver dock optimeras. En storskalig exosomtillverkningsmetod utvecklades i denna studie, baserad på massiv SF-MSC-kultur under xenofria förhållanden. Efter ultracentrifugering från cellodlingssupernatanter validerades exosomsäkerhet och funktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mesenkymala stamcellerna har använts i stor utsträckning inom regenerativ medicin på grund av deras självförnyelse, differentierade till vävnadsceller med specialiserade funktioner och parakrina effekter16,17. I synnerhet har de parakrina effekterna som utövas av exosomer väckt stor uppmärksamhet18. Exosomer bär bioinformation från MSC och utför sin biologiska funktion och övervinner MSC-brister, såsom besvärlig lagring o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Natural Science Foundation of China (nr 81972116, nr 81972085, nr 81772394); Nyckelprogram för naturvetenskapliga stiftelsen i Guangdong-provinsen (nr 2018B0303110003); Guangdongs internationella samarbetsprojekt (nr 2021A0505030011); Shenzhen vetenskaps- och teknikprojekt (nr. GJHZ20200731095606019, Nej. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kinas postdoktorala vetenskapsstiftelse (nr 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr 2021A1515010985); Sanming-projektet för medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Särskilda medel för byggandet av sjukhus på hög nivå i Guangdong-provinsen.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
Riferimenti
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -. J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
