Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması
Summary
Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Mezenkimal kök hücreler (MSC’ler) tarafından salgılanan eksozomlar, kıkırdak yaralanmaları ve osteoartrit tedavisi için umut verici adaylar olarak önerilmiştir. Klinik uygulama için eksozomlar büyük ölçekli üretim gerektirir. Bu amaçla, insan sinovyal sıvı MSC’leri (hSF-MSC’ler) mikro taşıyıcı boncuklar üzerinde yetiştirildi ve daha sonra dinamik üç boyutlu (3D) bir kültür sisteminde kültürlendi. 3D dinamik kültürü kullanarak, bu protokol SF-MSC kültür süpernatantlarından büyük ölçekli eksozomları başarıyla elde etti. Eksozomlar ultrasantrifüjleme ile toplandı ve bir iletim elektron mikroskobu, nanopartikül iletim testi ve batı lekelenmesi ile doğrulandı. Ayrıca, eksozomların mikrobiyolojik güvenliği tespit edildi. Eksozom tespitinin sonuçları, bu yaklaşımın çok sayıda iyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı eksozom üretebileceğini düşündürmektedir. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik osteoartrit tedavisinde kullanılabilir.
Introduction
Eklem kıkırdağı ve altta yatan kemik parçalanmasından kaynaklanan osteoartrit (OA), sakatlığa yol açan ciddi bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Kan ve sinir kaynağı olmadan, kıkırdak kendi kendini iyileştirme yeteneği bir kez yaralandığında minimumdur 3,4. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonuna (ACI) dayalı tedaviler OA tedavisinde bazı ilerlemeler kaydetmiştir5. Kondrosit izolasyonu ve genişlemesi için, OA ekleminin ağırlık taşımayan alanından küçük kıkırdak toplanması gereklidir ve bu da kıkırdakta yaralanmalara neden olur. Ayrıca, prosedür genişletilmiş kondrositleri implante etmek için ikinci bir operasyon gerektirecektir6. Bu nedenle, kıkırdak yaralanmaları olmadan OA tedavisi için tek aşamalı tedaviler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır.
Mezenkimal kök hücreler (MSC) OA tedavisinde umut verici alternatifler olarak önerilmiştir 7,8. Birden fazla dokudan kaynaklanan MSC’ler, spesifik stimülasyonla kondrositlere farklılaşabilir. Önemli olarak, MSC’ler anti-inflamasyon9 yoluyla bağışıklık tepkilerini modüle edebilir. Bu nedenle MSC’ler OA tedavisinde kıkırdak defektlerini onararak ve özellikle inflamasyon ortamında immün yanıtı modüle ederek önemli avantajlar sağlamaktadır. OA tedavisi için, sinovyal sıvıdan (SF-MSC’ler) MSC’ler, diğer MSC kaynaklarından daha güçlü kondrosit farklılaşma yetenekleri nedeniyle son zamanlarda çok dikkat çekmiştir10,11. Özellikle, ortopedik klinikte, eklem boşluğundan enflamatuar SF’nin çıkarılması, OA hastalarının ağrı semptomunu hafifletmek için rutin bir tedavidir. Ekstrakte edilen inflamatuar SF genellikle tıbbi atık olarak bertaraf edilir. Hem hastalar hem de doktorlar, inflamatuar SF’den izole edilen otolog MSC’leri çok az etik çatışma ile OA tedavisi olarak düşünmeye hazırdır. Bununla birlikte, SF-MSC tedavisi tümörojenik riskler, uzun süreli depolama ve uzak sevkiyat engelleri nedeniyle tehlikeye girmektedir.
MSC’ler de dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından salgılanan eksozomlar, ana hücre biyo-bilgisinin çoğunu taşır. Hücresiz tedavi olarak derinlemesine araştırılmıştır12,13. Klinik araştırma hükümeti (ClinicalTrials.gov) web sitesinde bulunan güncellenmiş kaynaklara göre, kanser, hipertansiyon ve nöro-dejeneratif hastalıkların araştırma alanlarında daha kapsamlı eksozom klinik çalışmaları başlatılmakta ve üstlenilmektedir. SF-MSC eksozom tedavisi, OA ile başa çıkmak için heyecan verici ve zorlu bir çalışma olabilir. İyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı ve büyük ölçekli eksozom üretimi klinik çeviri için gereklidir. Küçük ölçekli eksozom izolasyonu, iki boyutlu (2D) hücre kültürüne dayanarak yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli eksozom üretim stratejilerinin optimizasyona ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, ksenosuz koşullarda masif SF-MSC kültürüne dayanan büyük ölçekli bir eksozom üretim yöntemi geliştirilmiştir. Hücre kültürü süpernatantlarından ultrasantrifüjlemeden sonra, eksozom güvenliği ve fonksiyonu doğrulandı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mezenkimal kök hücreler, kendini yenilemeleri, özel fonksiyonlara sahip doku hücrelerine farklılaşmaları ve parakrin etkileri nedeniyle rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır16,17. Özellikle, eksozomlar tarafından uygulanan parakrin etkiler çok dikkat çekmiştir18. Eksozomlar, MSC’lerin biyo-bilgilerini taşır ve biyolojik işlevlerini yerine getirir ve zahmetli depolama ve sevkiyat gibi MSC eksikliklerinin üstes…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No.2018B0303110003); Guangdong Uluslararası İşbirliği Projesi (No.2021A0505030011); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (Hayır. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No.2020M682907); Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (No.2021A1515010985); Shenzhen’de Sanming Tıp Projesi (SZSM201612079); Guangdong Eyaletinde Üst Düzey Hastanelerin İnşaatı için Özel Fonlar.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
Riferimenti
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -. J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
