使用微流体混合平台为基因传递制订和定性脂质纳米粒子
Summary
脂质纳米粒子是使用微流体混合平台方法开发的，用于mRNA和DNA封装。
Abstract
基于脂质的药物载体由于体积小、生物相容性和封装效率高，已用于临床和商业上可用的交付系统。使用脂质纳米粒子（LNPs）封装核酸有利于保护RNA或DNA免受降解，同时促进细胞吸收。LNPs 通常含有多种脂质成分，包括电离子脂、辅助脂质、胆固醇和聚乙烯乙二醇 （PEG） 结合脂质。LNPs 可以很容易地封装核酸，由于电离子脂质的存在，在低 pH 值是阴离子的，并允许与负电压 RNA 或 DNA 的复合。在这里，LNPs是通过封装信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）形成的，使用有机相中的脂质成分和在声相中核酸成分的快速混合。这种混合使用精确的微流体混合平台进行，允许纳米粒子自组装，同时保持层流。水动力学大小和多散射是使用动态光散射 （DLS） 测量的。LNP 上的有效表面电荷通过测量 zeta 电位来确定。封装效率的特点是使用荧光染料来量化包裹的核酸。具有代表性的结果表明，该方法具有可重复性，并且不同的配方和工艺参数对已开发的 LNP 具有影响。
Introduction
药物携带者用于保护和提供具有典型有利特性的治疗，包括低细胞毒性，增加生物可用性，并改善稳定性1，2，3。聚合物纳米粒子、鼠类和脂质粒子以前曾被探索过核酸封装和输送4、5、6、7。脂质已用于不同类型的纳米载体系统，包括脂质体和脂质纳米粒子，因为它们与高稳定性8生物相容。LNPs可以很容易地封装核酸的基因传递9，10。它们保护核酸在系统循环过程中不受血清蛋白酶的降解，并可以改善对特定部位的输送，因为LNPs的表面地形和物理特性会影响其生物分布12。LNPs还改善组织渗透和细胞吸收9。先前的研究表明，在LNP13中，西RNA封装取得了成功，包括首个含有西RNA治疗遗传性转乙酰激素介质淀粉样体病的LNP治疗药物，该疗法于2018年获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局的批准。最近，正在研究LNPs的交付更大的核酸，即mRNA和DNA9。截至2018年，有+22个基于脂质的核酸输送系统正在进行临床试验14。此外，含有LNPs的mRNA目前是主要候选者，并已受雇于COVID-19疫苗15，16。这些非病毒基因疗法的潜在成功需要形成小（+100 nm），稳定和均匀的粒子与高核酸封装。
在LNP配方中使用电离子脂作为主要成分，在复合、封装和递送效率14方面显示出优势。离子脂质通常具有酸分离常数 （pKa） < 7：例如，二烯酰-4-二甲基丁基丁酸酯（D-Lin-MC3-DMA），在FDA批准的LNP配方中使用的电离子脂质，pKa为6.4417。在低pH值下，电离子脂质上的胺组变得质子化和正电荷，允许在mRNA和DNA上与负电荷磷酸盐组组装。胺、”N”、组与磷酸盐、”P”的比例，用于优化组件。N/P比率取决于使用的脂质和核酸，根据配方18而异。形成后，pH值可调整为中性或生理pH值，以便进行治疗管理。在这些 pH 值下，电离脂质也脱质，从而向 LNP 提供中性表面电荷。
电离子脂也有助于内分泌逃生19，20。LNPs在细胞吸收过程中接受内分泌，必须从内皮体中释放出来，以便将mRNA货物送入细胞质或DNA货物到细胞核21。内皮体内部通常比细胞外介质更酸性，使电离子脂质正电荷22，23。带正电荷的电离子脂质可与内分泌脂膜上的负电荷相互作用，从而导致内皮体不稳定，从而释放LNP和核酸。目前正在研究不同的电离子脂质，以提高LNP分布的功效，以及内分泌逃逸14。
LNP 的其他典型成分包括辅助脂质，如磷脂酰胆碱 （PC） 或磷乙醇胺 （PE） 脂质。1，2-二甲苯-sn-甘油-3-磷乙醇胺（多普），1，2-二乙酰-sn-甘油-3-磷 磷胆碱 （DSPC）， 和 1，2 二醇 – sn-甘油-3 磷胆碱 （DOPC） 是常用的辅助脂质24，25.DOPE已被证明形成一个倒置的六边形II（HII）相，并通过膜融合26增强透射，而DSPC已被认为稳定LNPs与圆柱形几何27。胆固醇也被纳入配方，以增加膜刚度，随后有助于LNP的稳定。最后，脂质结合聚乙烯乙二醇（PEG）被纳入配方，以提供必要的石碑屏障，以帮助在粒子自组装27。PEG 还通过防止聚合来提高 LNP 的存储稳定性。此外，PEG 经常被用作隐形组件，可以增加 LNP 的循环时间。然而，这一属性也可能构成挑战，招募LNPs肝细胞通过内源性定位机制驱动的阿波利波蛋白E（ApoE）28。因此，研究已经调查了从LNP扩散PEG的乙酰链长度，发现短长度（C8-14）与LNP分离，更适合ApoE招募相比，更长的乙酰长度28。此外，PEG 与之结合的脂质尾巴饱和程度已证明会影响 LNPs29的组织分布。最近，Tween 20，这是生物药物制剂中常用的表面活性剂，具有长期不饱和脂质的尾巴，与PEG-DSPE相比，在排出淋巴结方面具有很高的转化性，PEG-DSPE主要在注射部位29处对肌肉进行透射。此参数可以优化，以实现所需的 LNP 生物分布。
传统的LNP形成方法包括薄膜水化法和乙醇注射法27。虽然这些是现成的技术，他们也是劳动密集型的，可能会导致低封装效率，并具有挑战性地扩大27。混合技术的进步使得方法更易放大，同时开发出更均匀的粒子27。这些方法包括T结混合，交错鱼骨混合，微流体流体动力学聚焦27。每种方法都有独特的结构，但都允许快速混合含有核酸的一个液态与含有脂质成分的有机相，从而产生高封装的核酸27。在此协议中，利用通过微流体墨盒进行快速和可控的混合，采用交错的鱼骨混合设计。本协议概述了含有 LNPs 的核酸的制备、组装和定性。
Protocol
Representative Results
Discussion
与其他现有方法（如脂膜水化和乙醇注射）相比，可重复性、速度和低体积筛选是使用微流体混合形成 LNP 的重要优势。我们已经证明了这种方法的可重复性，对用不同的LNP批次观察到的封装效率或颗粒大小没有影响。这是任何治疗，包括LNPs，成为临床可用的基本标准。
这里描述的技术采用交错的鱼骨微流体混合，这导致LNP形成的时间尺度只有几分钟。这种混合使用混沌的?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
感谢阿图尔·萨卢贾、亚廷·戈卡恩、玛丽亚-特雷莎·佩拉基亚、沃尔特·施文格和菲利普·扎卡斯对LNP发展的指导和贡献。
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
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