Het formuleren en karakteriseren van lipide nanodeeltjes voor genafgifte met behulp van een microfluïdisch mengplatform
Summary
Lipide nanodeeltjes worden ontwikkeld met behulp van een microfluïdische mengplatformbenadering voor mRNA- en DNA-inkapseling.
Abstract
Op lipiden gebaseerde medicijndragers zijn gebruikt voor klinisch en commercieel beschikbare toedieningssystemen vanwege hun kleine formaat, biocompatibiliteit en hoge inkapselingsefficiëntie. Het gebruik van lipide nanodeeltjes (LNP’s) om nucleïnezuren in te kapselen is voordelig om het RNA of DNA te beschermen tegen afbraak, terwijl het ook de cellulaire opname bevordert. LNP’s bevatten vaak meerdere lipidecomponenten, waaronder een ioniseerbare lipide, helperlipide, cholesterol en polyethyleenglycol (PEG) geconjugeerd lipide. LNP’s kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen vanwege de ioniseerbare lipideaanwezigheid, die bij lage pH kationisch is en complexatie mogelijk maakt met negatief geladen RNA of DNA. Hier worden LNP’s gevormd door het inkapselen van boodschapper-RNA (mRNA) of plasmide-DNA (pDNA) met behulp van snelle menging van de lipidecomponenten in een organische fase en de nucleïnezuurcomponent in een waterige fase. Dit mengen wordt uitgevoerd met behulp van een nauwkeurig microfluïdisch mengplatform, waardoor zelfassemblage van nanodeeltjes mogelijk is met behoud van de laminaire stroom. De hydrodynamische grootte en polydispersiteit worden gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS). De effectieve oppervlaktelading op de LNP wordt bepaald door de zetapotentiaal te meten. De inkapselingsefficiëntie wordt gekenmerkt met behulp van een fluorescerende kleurstof om ingesloten nucleïnezuur te kwantificeren. Representatieve resultaten tonen de reproduceerbaarheid van deze methode en de invloed die verschillende formulerings- en procesparameters hebben op de ontwikkelde LNP’s.
Introduction
Medicijndragers worden gebruikt om een therapeutisch middel te beschermen en af te leveren met typische gunstige eigenschappen, waaronder lage cytotoxiciteit, verhoogde biologische beschikbaarheid en verbeterde stabiliteit1,2,3. Polymere nanodeeltjes, micellen en op lipiden gebaseerde deeltjes zijn eerder onderzocht voor nucleïnezuurinkapseling en -afgifte4,5,6,7. Lipiden zijn gebruikt in verschillende soorten nanodragersystemen, waaronder liposomen en lipide nanodeeltjes, omdat ze biocompatibel zijn met een hoge stabiliteit8. LNP’s kunnen gemakkelijk nucleïnezuren inkapselen voor genafgifte9,10. Ze beschermen het nucleïnezuur tegen afbraak door serumproteasen tijdens systemischecirculatie 11 en kunnen de afgifte op specifieke locaties verbeteren, omdat de oppervlaktetopografie en fysische eigenschappen van LNP’s hun biodistributie beïnvloeden12. LNP’s verbeteren ook de weefselpenetratie en cellulaire opname9. Eerdere studies hebben het succes aangetoond van siRNA-inkapseling binnen een LNP13, waaronder de eerste commercieel verkrijgbare LNP-bevattende siRNA-therapeutische voor de behandeling polyneuropathie van erfelijke transthyretine-gemedieerde amyloïdose14-behandeling die in 2018 werd goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) en het Europees Geneesmiddelenbureau. Meer recent worden LNP’s bestudeerd voor de afgifte van grotere nucleïnezuurmoieties, namelijk mRNA en DNA9. Vanaf 2018 waren er ~ 22 op lipiden gebaseerde nucleïnezuurafgiftesystemen die klinische onderzoeken ondergingen14. Bovendien zijn mRNA-bevattende LNP’s momenteel leidende kandidaten en zijn ze gebruikt voor een COVID-19-vaccin15,16. Het potentiële succes voor deze niet-virale gentherapieën vereist het vormen van kleine (~ 100 nm), stabiele en uniforme deeltjes met een hoge inkapseling van het nucleïnezuur.
Het gebruik van een ioniseerbare lipide als hoofdbestanddeel in de LNP-formulering heeft voordelen aangetoond voor complexatie, inkapseling en afgifte-effciciency14. Ioniseerbare lipiden hebben meestal een zuurdissociatieconstante (pKa) < 7; dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyraat (D-Lin-MC3-DMA), het ioniseerbare lipide dat wordt gebruikt in de door de FDA goedgekeurde LNP-formulering, heeft bijvoorbeeld een pKa van 6,4417. Bij lage pH worden de aminegroepen op het ioniseerbare lipide geprotoneerd en positief geladen, waardoor de assemblage met negatief geladen fosfaatgroepen op mRNA en DNA mogelijk wordt. De verhouding van amine, “N”, groepen tot fosfaat, “P”, groepen wordt gebruikt om de assemblage te optimaliseren. De N/P-verhouding is afhankelijk van de gebruikte lipiden en nucleïnezuren, die varieert afhankelijk van de formulering18. Na de vorming kan de pH worden aangepast aan een neutrale of fysiologische pH om therapeutische toediening mogelijk te maken. Bij deze pH-waarden wordt het ioniseerbare lipide ook gedeprotoneerd, wat een neutrale oppervlaktelading aan de LNP verleent.
Het ioniseerbare lipide helpt ook bij endosomale ontsnapping19,20. LNP’s ondergaan endocytose tijdens cellulaire opname en moeten worden vrijgegeven uit het endosoom om de mRNA-lading in het celcytoplasma of DNA-lading naar de kern af te leveren21. In het endosoom bevindt zich meestal een meer zure omgeving dan het extracellulaire medium, waardoor het ioniseerbare lipide positief geladenis 22,23. Het positief geladen ioniseerbare lipide kan interageren met negatieve ladingen op het endosomale lipidemembraan, wat destabilisatie van het endosoom kan veroorzaken waardoor de LNP en het nucleïnezuur vrijkomen. Verschillende ioniseerbare lipiden worden momenteel bestudeerd voor het verbeteren van de werkzaamheid van zowel LNP-distributie als endosomale ontsnapping14.
Andere typische componenten van een LNP zijn helperlipiden, zoals een fosfatidylcholine (PC) of fosfoethanolamine (PE) lipide. 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DSPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) zijn veelgebruikte helperlipiden24,25. Van DOPE is aangetoond dat het een omgekeerde hexagonale II (HII) fase vormt en de transfectie verbetert door membraanfusie26, terwijl van DSPC wordt gedacht dat het LNP’s stabiliseert met zijn cilindrische geometrie27. Cholesterol wordt ook in de formulering opgenomen om de stijfheid van het membraan te verhogen, wat vervolgens helpt bij de stabiliteit van de LNP. Ten slotte is lipide-geconjugeerde polyethyleenglycol (PEG) opgenomen in de formulering om de nodige sterische barrière te bieden om te helpen bij de zelfassemblage van deeltjes27. PEG verbetert ook de opslagstabiliteit van LNP’s door aggregatie te voorkomen. Bovendien wordt PEG vaak gebruikt als stealth-component en kan het de circulatietijd voor de LNP’s verlengen. Dit attribuut kan echter ook uitdagingen opleveren voor de rekrutering van LNP’s voor hepatocyten via een endogene targetingmechanisme aangedreven door apolipoproteïne E (ApoE)28. Studies hebben dus de acylketenlengte onderzocht voor diffusie van PEG uit de LNP, en vonden dat korte lengtes (C8-14) zich distantiëren van de LNP en meer vatbaar zijn voor ApoE-rekrutering in vergelijking met langere acyllengtes28. Verder is aangetoond dat de mate van verzadiging van de lipidestaart waarmee PEG is geconjugeerd, de weefselverdeling van LNP’sbeïnvloedt 29. Onlangs werd aangetoond dat Tween 20, een veelgebruikte oppervlakteactieve stof in biologische geneesmiddelformuleringen en een lange onverzadigde lipidestaart heeft, een hoge transfectie heeft in drainerende lymfeklieren in vergelijking met PEG-DSPE, die de spier op de injectieplaats grotendeels transfecteerde29. Deze parameter kan worden geoptimaliseerd om de gewenste LNP-biodistributie te bereiken.
Conventionele methoden voor het vormen van LNP’s omvatten de dunnefilmhydratatiemethode en ethanolinjectiemethode27. Hoewel dit direct beschikbare technieken zijn, zijn ze ook arbeidsintensief, kunnen ze resulteren in een lage inkapselingsefficiëntie en zijn ze een uitdaging om op teschalen 27. Vooruitgang in mengtechnieken heeft geresulteerd in methoden die beter kunnen worden opgeschaald, terwijl meer uniforme deeltjes wordenontwikkeld 27. Deze methoden omvatten T-junctiemenging, gespreide visgraatmenging en microfluïdische hydrodynamische focus27. Elke methode heeft een unieke structuur, maar ze maken allemaal een snelle menging mogelijk van een waterige fase die het nucleïnezuur bevat met een organische fase die de lipidecomponenten bevat, wat resulteert in een hoge inkapseling van het nucleïnezuur27. In dit protocol wordt gebruik gemaakt van snel en gecontroleerd mengen door een microfluïdische cartridge, die het verspringende visgraatmengontwerp gebruikt. Dit protocol schetst de voorbereiding, assemblage en karakterisering van nucleïnezuur dat LNP’s bevat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reproduceerbaarheid, snelheid en screening met een laag volume zijn belangrijke voordelen van het gebruik van microfluïdische menging om LNP’s te vormen in vergelijking met andere bestaande methoden (bijv. Lipid film hydratatie en ethanolinjectie). We hebben de reproduceerbaarheid van deze methode aangetoond zonder impact op de inkapselingsefficiëntie of deeltjesgrootte waargenomen met verschillende LNP-batches. Dit is een essentieel criterium voor elk therapeutisch middel, inclusief LNP’s, om klinisch beschikbaar te w…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dank aan Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger en Philip Zakas voor hun begeleiding en bijdragen aan de ontwikkeling van LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
Riferimenti
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
