גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית
Summary
חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.
Abstract
נשאי תרופות מבוססי שומנים שימשו למערכות אספקה זמינות קלינית ומסחרית בשל גודלן הקטן, תאימות ביולוגית ויעילות אנקפסולציה גבוהה. השימוש בננו-חלקיקי שומנים בדם (LNPs) כדי לתמצת חומצות גרעין הוא יתרון כדי להגן על ה- RNA או ה- DNA מפני השפלה, תוך קידום ספיגת התאים. LNPs מכילים לעתים קרובות רכיבי שומנים מרובים כולל שומנים מיומנים, שומנים עוזרים, כולסטרול, פוליאתילן גליקול (PEG) שומנים מצומדים. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין בשל נוכחות שומנים מיונן, אשר ב- pH נמוך הוא קטי ומאפשר קומפלקס עם RNA טעון שלילית או DNA. כאן LNPs נוצרים על ידי אנקפסולציה RNA messenger (mRNA) או DNA plasmid (pDNA) באמצעות ערבוב מהיר של רכיבי השומנים בשלב אורגני ואת רכיב חומצת הגרעין בשלב מימי. ערבוב זה מתבצע באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית מדויקת, המאפשרת הרכבה עצמית ננו-חלקיקית תוך שמירה על זרימת למינאר. הגודל ההידרודינמי והפולידיספרסיות נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). מטען פני השטח היעיל על LNP נקבע על ידי מדידת פוטנציאל הזטה. יעילות אנקפסולציה מאופיינת באמצעות צבע פלואורסצנטי כדי לכמת חומצת גרעין לכודה. תוצאות מייצגות מדגימות את יכולת הרבייה של שיטה זו ואת ההשפעה שיש לפרמטרים שונים של ניסוח ותהליכים על ה- LNPs המפותחים.
Introduction
נשאי סמים משמשים כדי להגן ולספק טיפול עם תכונות חיוביות טיפוסיות כולל ציטוטוקסיות נמוכה, זמינות ביולוגית מוגברת, ויציבות משופרת1,2,3. חלקיקים פולימריים, מיצלים וחלקיקים מבוססי שומנים נחקרו בעבר עבור אנקפסולציה של חומצת גרעין ואספקה4,5,6,7. שומנים שימשו סוגים שונים של מערכות nanocarrier, כולל ליפוזומים, חלקיקי שומנים בדם, כפי שהם תואמים ביולוגית עם יציבות גבוהה8. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין עבור אספקתגנים 9,10. הם מגנים על חומצת הגרעין מפני השפלה על ידי פרוטאזים בסרום במהלך מחזור מערכתי11 ויכולים לשפר את המסירה לאתרים ספציפיים, כמו טופוגרפיה פני השטח ואת המאפיינים הפיזיים של LNPs להשפיע על ייחוס ביולוגישלהם 12. LNPs גם לשפר את חדירת הרקמות ואת ספיגת התא9. מחקרים קודמים הדגימו את ההצלחה של אנקפסולציה siRNA בתוך LNP13, כולל LNP הראשון זמין מסחרית המכיל siRNA טיפולי לטיפול polyneuropathy של עמילואידוזיס תורשתי בתיווך transthyretin14 טיפול שאושר על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) וסוכנות התרופות האירופית בשנת 2018. לאחרונה, LNPs נחקרים על משלוח של moieties חומצת גרעין גדולה יותר, כלומר mRNA ו- DNA9. נכון ל-2018, היו ~ 22 מערכות אספקת חומצת גרעין מבוססות שומנים שעברו ניסויים קליניים14. בנוסף, mRNA המכיל LNPs הם כיום מועמדים מובילים והם מועסקים עבור חיסון COVID-1915,16. ההצלחה הפוטנציאלית של טיפולים גנטיים לא ויראליים אלה דורשת יצירת חלקיקים קטנים (~ 100 ננומטר), יציבים ואחידים עם אנקפסולציה גבוהה של חומצת הגרעין.
השימוש בשומנים מיינים כמרכיב עיקרי בניסוח LNP הראה יתרונות לתת-עור, אנקפסולציה וגמישות מסירה14. שומנים יונים בדרך כלל יש קבוע דיסוציאציה חומצה (pKa) < 7; לדוגמה, דילינולימלמתיל-4-דימתילאמינובוטיראט (D-Lin-MC3-DMA), השומנים היוניים המשמשים בניסוח LNP שאושר על ידי ה-FDA, יש pKa של 6.4417. ברמת ה-pH הנמוכה, קבוצות האמין על השומנים היונים הופכות פרוטוניות וטעונות באופן חיובי, ומאפשרות את ההרכבה עם קבוצות פוספט טעונות שליליות על mRNA ו- DNA. היחס של אמין, “N”, קבוצות פוספט, “P”, קבוצות משמש כדי לייעל את ההרכבה. יחס N/P תלוי שומנים וחומצות גרעין בשימוש, אשר משתנה בהתאם ניסוח18. לאחר היווצרות, ה- pH יכול להיות מותאם ל- pH נייטרלי או פיזיולוגי כדי לאפשר ניהול טיפולי. בערכי pH אלה, השומנים היוניים הוא גם deprotonated אשר מחדיר מטען משטח נייטרלי LNP.
השומנים היוניים מסייעים גם בבריחה אנדוסומלית19,20. LNPs עוברים אנדוציטוזיס במהלך ספיגת התא ויש לשחרר מן endosome על מנת להעביר את המטען mRNA לתוך ציטופלסמה התא או מטען DNA לגרעין21. בתוך אנדוזום היא בדרך כלל סביבה חומצית יותר מאשר המדיום החוץ תאי, אשר הופך את השומנים היונים טעון חיובי22,23. השומנים היונים הטעונים באופן חיובי יכולים לקיים אינטראקציה עם מטענים שליליים על קרום השומנים האנדוזום, אשר יכול לגרום לערעור היציבות של אנדוזום המאפשר את שחרורו של LNP וחומצת גרעין. שומנים שונים מיומנים נחקרים כעת לשיפור היעילות של הפצת LNP, כמו גם בריחה אנדוסומלית14.
רכיבים אופייניים אחרים של LNP כוללים שומנים עוזרים, כגון פוספטידילכולין (PC) או פוספוטנולמין (PE) שומנים. 1,2-דיאולאויל-סן-גליצרי-3-פוספוטנולמין (DOPE), 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (DSPC), ו-1,2-דיאולאויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (DOPC) הם ליפידים עוזרים נפוצים24,25. DOPE הוכח ליצור שלב משושה II הפוך (HII) ולשפר את transfection על ידי היתוךממברנה 26, בעוד DSPC נחשב לייצב LNPs עם הגיאומטריה הגלילית שלה27. כולסטרול משולב גם ניסוח על מנת להגביר את קשיחות הממברנה, לאחר מכן סיוע ביציבות של LNP. לבסוף, פוליאתילן גליקול מצומד שומנים בדם (PEG) כלול בניסוח כדי לספק את המחסום הסיסטרי הדרוש כדי לסייע בהרכבה עצמית חלקיקים27. PEG גם משפר את יציבות האחסון של LNPs על-ידי מניעת צבירה. יתר על כן, PEG משמש לעתים קרובות כרכיב התגנבות והוא יכול להגדיל את זמן זרימת הדם עבור LNPs. עם זאת, תכונה זו יכולה גם להציב אתגרים לגיוס LNPs להפטוציטים באמצעות מנגנון פילוח אנדוגני המונע על ידי apolipoprotein E (ApoE)28. לכן, מחקרים חקרו את אורך שרשרת האציל לפיזור PEG מה- LNP, ומצאו כי אורכים קצרים (C8-14) מנותקים מה- LNP והם נוחים יותר לגיוס ApoE בהשוואה לאורכים ארוכים יותרשל אציל 28. כמו כן, מידת הרוויה של זנב השומנים כי PEG הוא מצומד הוכח להשפיע על התפלגות הרקמה של LNPs29. לאחרונה, Tween 20, שהוא חומר פעילי שטח נפוץ בפורמולציות של מוצרי תרופות ביולוגיות ויש לו זנב שומנים ארוך ולא רווי, הוכח כבעל transfection גבוה בניקוז בלוטות הלימפה בהשוואה PEG-DSPE, אשר במידה רבה עבר את השריר באתר ההזרקה29. פרמטר זה יכול להיות ממוטב כדי להשיג את ההפצה הביולוגית הרצויה LNP.
שיטות קונבנציונליות ליצירת LNPs כוללות את שיטת הידרציה סרט דק שיטת הזרקת אתנול27. בעוד אלה הן טכניקות זמינות, הם גם עבודה אינטנסיבית, יכול לגרום יעילות אנקפסולציה נמוכה, והם מאתגרים להגדילאת 27. ההתקדמות בטכניקות ערבוב הביאה לשיטות נוחות יותר להרחבה, תוך פיתוח חלקיקים אחידים יותר27. שיטות אלה כוללות ערבוב צומת T, ערבוב הרינגבון מתנודד, ומיקוד הידרודינמי מיקרופלואידי27. לכל שיטה מבנה ייחודי, אך כולם מאפשרים ערבוב מהיר של שלב מימי המכיל את חומצת הגרעין עם שלב אורגני המכיל את רכיבי השומנים, וכתוצאה מכך אנקפסולציה גבוהה של חומצת הגרעין27. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בערבוב מהיר ומבוקר באמצעות מחסנית מיקרופלואידית, המשתמשת בעיצוב ערבוב הרינגבון המהדהד. פרוטוקול זה מתאר את ההכנה, ההרכבה והאפיון של חומצת גרעין המכילה LNPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
רבייה, מהירות, הקרנה בנפח נמוך הם יתרונות משמעותיים של שימוש בערבוב microfluidic כדי ליצור LNPs לעומת שיטות קיימות אחרות (למשל, הידרציה סרט השומנים הזרקת אתנול). הדגמנו את יכולת הרבייה של שיטה זו ללא השפעה על יעילות אנקפסולציה או גודל חלקיקים שנצפו עם אצוות LNP שונות. זהו קריטריון חיוני עבור כל טיפול…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תודה לאטול סלוג’ה, יאטין גוקארן, מריה-תרזה פראצ’יה, וולטר שוונגר ופיליפ זאקאס על הדרכתם ותרומתם לפיתוח LNP.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
Riferimenti
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
