Summary

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Published: February 25, 2021
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Summary

脂質ナノ粒子は、mRNAおよびDNAカプセル化のためのマイクロ流体混合プラットフォームアプローチを用いて開発される。

Abstract

脂質ベースの薬物キャリアは、サイズが小さく、生体適合性、高いカプセル化効率のために、臨床的および商業的に入手可能な送達システムに使用されてきました。核酸をカプセル化する脂質ナノ粒子(LnPs)の使用は、RNAまたはDNAを分解から保護するのに有利であり、細胞の取り込みを促進する。LNPは、多くの場合、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール(PEG)結合脂質を含む複数の脂質成分を含みます。LNPは、イオン化可能な脂質存在に起因する核酸を容易に封入することができ、これは低pHでカチオンであり、負に荷電したRNAまたはDNAとの複合体化を可能にする。ここでLNPは、有機相中の脂質成分と核酸成分を水相で迅速に混合してメッセンジャーRNA(mRNA)またはプラスミドDNA(pDNA)を封入することによって形成される。この混合は精密なマイクロ流体混合プラットフォームを使用して行われ、層流を維持しながらナノ粒子自己集合を可能にする。流体力学のサイズと多分散は、ダイナミック光散乱(DLS)を使用して測定されます。LNP上の有効表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定される。カプセル化効率は、蛍光色素を使用して、封じ込められた核酸を定量化することを特徴としている。代表的な結果は、この方法の再現性と、異なる製剤およびプロセスパラメータが開発されたLNPに及ぼす影響を示す。

Introduction

薬物キャリアは、低細胞毒性、バイオアベイラビリティの増加、および安定性の向上1、2、3を含む典型的な好ましい特性を有する治療を保護し提供するために使用される。ポリマーナノ粒子、ミセル、および脂質ベースの粒子は、核酸カプセル化および送達4、5、6、7について以前に検討されてきた。脂質は、高い安定性8と生体適合性であるため、リポソーム、および脂質ナノ粒子を含む異なるタイプのナノキャリア系で使用されてきた。LNPは遺伝子送達核酸を容易に封入できる9,10.それらは、全身循環11の間に血清プロテアーゼによる分解から核酸を保護し、特定の部位への送達を改善することができ、LNPの表面地形および物性がそれらの生物分布12に影響を及ぼす。LNPはまた、組織の浸透と細胞の取り込み9を改善します。これまでの研究では、2018年に米国食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁によって承認された遺伝性経サイレチン媒介性アミロイドーシス14治療の治療用siRNA治療を含む最初の市販LNPを含むLNP13内でのsiRNAカプセル化の成功が実証されている。最近では、Lnpは、より大きな核酸部分、すなわちmRNAとDNA9の送達のために研究されている。2018年現在、臨床試験を受けている脂質ベースの核酸送達系は~22個あった。さらに、LNPを含むmRNAは現在有力な候補であり、COVID-19ワクチン15,16に採用されている。これらの非ウイルス性遺伝子治療の潜在的な成功は、核酸のカプセル化が高い小さな(〜100nm)、安定した均一な粒子を形成する必要があります。

LNP製剤中の主成分としてのイオン化可能脂質の使用は、複素化、カプセル化、及び送達のeffciciency14に対する利点を示している。イオン化可能な脂質は、典型的には酸解離定数(pKa)を有<7;例えば、ジリノールメチル-4-ジメチルアミノブチレート(D-Lin-MC3-DMA)は、FDA承認LNP製剤に用いられるイオン化可能な脂質を、6.4417のpKaを有する。低pHでは、イオン化可能な脂質上のアミン基がプロトン化され、正に荷電し、mRNAおよびDNA上に負に荷電したリン酸基を有する組立が可能になる。アミンの比率は、「N」、リン酸塩に対する基、「P」、基が組み立てを最適化するために使用される。N/P比は、使用される脂質および核酸に依存し、製剤18によって異なる。形成後、pHは中性または生理学的pHに調節して、治療的投与を可能にすることができる。これらのpH値では、電化可能な脂質も脱プロトン化され、中性表面電荷をLNPに付与する。

このイオン化脂質は、内経脱出19,20にも役立。LNPは細胞取り込み中にエンドサイトーシスを受け、細胞細胞質またはDNA貨物にmRNA貨物を核21に送達するためにエンドソームから放出されなければならない。内の内部は、通常、細胞外媒体よりも酸性の環境であり、イオン性脂質を正に22、23に充電する。正に荷電したイオン化可能な脂質は、内膜脂質膜上の負電荷と相互作用し、これが、LNPおよび核酸の放出を可能にする内因性の不安定化を引き起こす可能性がある。異なる電化脂質は、現在、両方のLNP分布の有効性を改善するために研究されている、 ならびに内経体脱出14。

LNPの他の典型的な成分は、ホスファチジルコリン(PC)またはホスホエタノールアミン(PE)脂質などのヘルパー脂質を含む。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、および1,2-ジオレオイル-snグリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)が一般的に使用されているヘルパー脂質24,25。DOPEは、反転六角形II(HII)相を形成し、膜融合26によってトランスフェクションを増強することが示されているが、DSPCはその円筒形状27でLNPsを安定化させると考えられている。コレステロールはまた、膜剛性を高めるために製剤に組み込まれ、その後、LNPの安定性を助ける。最後に、脂質共役ポリエチレングリコール(PEG)が、粒子自己集合性27に助けるために必要な立体的障壁を提供するために製剤に含まれる。また、PEG は集約を防止することで LNP のストレージの安定性を向上させます。さらに、PEG はステルスコンポーネントとしてよく使用され、LNP の循環時間を長くすることができます。しかし、この属性はまた、アポリポタンパクE(ApoE)28によって駆動される内因性標的機構を介して肝細胞へのLNPの採用に対する課題を提起する可能性がある。従って、研究は、LNPからのPEGの拡散のためのアシル鎖長さを調査し、短い長さ(C8-14)がLNPから解離し、より長いアシル長28と比較してApoE採用に対してより適性であることを発見した。また、PEGが共役する脂質尾の飽和度合いは、LNPs29の組織分布に影響を与えることを示している。近年、Tween 20は、生物学的薬剤製品製剤に一般的に使用される界面活性剤であり、長い不飽和脂質尾を有するが、PEG-DSPEと比較してリンパ節の排出において高いトランスフェクションを有することが示されたが、これは注射部位29で筋肉を大部分トランスフェクトした。このパラメータは、望ましいLNPバイオディストリビューションを達成するために最適化することができます。

LNPsの形成の従来の方法は、薄膜水和法およびエタノール注入法27を含む。これらは容易に入手できる技術であるが、それらはまた、労働集約的であり、低いカプセル化効率をもたらし、そして27をスケールアップすることは困難である。混合技術の進歩は、より均一な粒子27を開発しながら、スケールアップに適した方法をもたらしました。これらの方法には、T-接合部混合、ずらしてヘリンボーン混合、及び微流体流体力学的集化27が含まれる。各方法は、固有の構造を有するが、全ては、脂質成分を含む有機相を有する核酸を含む水相を迅速に混合することを可能にし、結果として核酸27の高い封入を生じる。このプロトコルでは、マイクロ流体カートリッジを介した迅速かつ制御混合が利用され、ずらしたヘリンボーン混合設計を採用しています。このプロトコルは、LNPを含む核酸の調製、組立、および特性を概説する。

Protocol

全体的なプロセスの概略を図 1に示します。 1. バッファの準備 注:バッファーの滅菌フィルタリングは、核酸およびLNP品質に影響を与える可能性のある微粒子を除去するために、ここで非常に推奨されています。 リン酸緩衝生理食塩分 (PBS) 8 mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137 mM NaCl、およびヌ?…

Representative Results

同じ脂質製剤と6のN/P比を有するLNPの複数のバッチを別々の日に開発し、この技術の再現性を実証した。バッチ1と2は、類似した多分散性を有する重なり合うサイズ分布をもたらした(図2A)2つの異なるバッチ間のサイズまたはカプセル化効率に有意な差は認められなかった(図2B)。カプセル化効率はバッチ毎に高く(>98.5%)、サ?…

Discussion

再現性、速度、および低体積スクリーニングは、マイクロ流体混合を用いて、他の既存の方法(例えば、脂質フィルム水和およびエタノール注入)と比較してLNPを形成する重要な利点である。我々は、異なるLNPバッチで観察されるカプセル化効率または粒子サイズに影響を与えなく、この方法の再現性を実証した。これは、Lnpsを含むあらゆる治療が臨床的に利用可能になるための不可欠な基準?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アトゥル・サルヤ、ヤティン・ゴカーン、マリア・テレサ・ペラッキア、ウォルター・シュヴェンゲル、フィリップ・ザカスの指導とLNP開発への貢献に感謝します。

Materials

1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

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Citazione di questo articolo
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

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