Summary

Formulera och karakterisera Lipid Nanopartiklar för genleverans med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform

Published: February 25, 2021
doi:

Summary

Lipidnanopartiklar utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsplattform för mRNA- och DNA-inkapsling.

Abstract

Lipidbaserade läkemedelsbärare har använts för kliniskt och kommersiellt tillgängliga leveranssystem på grund av deras lilla storlek, biokompatibilitet och höga inkapslingseffektivitet. Användning av lipidnanopartiklar (LNPs) för att kapsla in nukleinsyror är fördelaktigt för att skydda RNA eller DNA från nedbrytning, samtidigt som cellulärt upptag främjas. LNPs innehåller ofta flera lipidkomponenter inklusive en joniserbar lipid, hjälpare lipid, kolesterol och polyetylenglykol (PEG) konjugerad lipid. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror på grund av den joniserbara lipidförekomsten, som vid lågt pH-upphetsningsmedel och möjliggör hy med negativt laddat RNA eller DNA. Här bildas LNPs genom att kapsla in budbärar-RNA (mRNA) eller plasmid-DNA (pDNA) med snabb blandning av lipidkomponenterna i en organisk fas och nukleinsyrakomponenten i en vattenfas. Denna blandning utförs med hjälp av en exakt mikrofluidisk blandningsplattform, vilket möjliggör självmontering av nanopartiklar samtidigt som laminärt flöde bibehålls. Den hydrodynamiska storleken och polydispersiteten mäts med hjälp av dynamisk ljusspridning (DLS). Den effektiva ytladdningen på LNP bestäms genom att mäta zetapotentialen. Inkapslingseffektiviteten kännetecknas av ett fluorescerande färgämne för att kvantifiera inspädd nukleinsyra. Representativa resultat visar reproducerbarheten av denna metod och det inflytande som olika formulerings- och processparametrar har på de utvecklade LNP: erna.

Introduction

Läkemedelsbärare används för att skydda och leverera en terapeutisk med typiska gynnsamma egenskaper inklusive låg cytotoxicitet, ökad biotillgänglighet och förbättrad stabilitet1,2,3. Polymera nanopartiklar, micelles och lipidbaserade partiklar har tidigare undersökts för nukleinsyrainkapsling ochleverans 4,5,6,7. Lipider har använts i olika typer av nanokarriersystem, inklusive liposomer, och lipidnanopartiklar, eftersom de är biokompatierbara medhög stabilitet 8. LNPs kan lätt kapsla in nukleinsyror för genleverans9,10. De skyddar nukleinsyran från nedbrytning genom serumproteaser undersystemcirkulationen 11 och kan förbättra leveransen till specifika platser, eftersom LNPs yttopografi och fysiska egenskaper påverkar deras biodistribution12. LNPs förbättrar också vävnad penetration och cellulär upptag9. Tidigare studier har visat framgången för siRNA-inkapsling inom en LNP13, inklusive den första kommersiellt tillgängliga LNP som innehåller siRNA terapeutisk för behandling polyneuropati av ärftlig transthyretin-medierad amyloidos14-behandling som godkändes av United States Food and Drug Administration (FDA) och European Medicines Agency 2018. På senare tid studeras LNPs för leverans av större nukleinsyramoieties, nämligen mRNA och DNA9. Från och med 2018 fanns det ~ 22 lipidbaserade nukleinsyraleveranssystem som genomgår kliniska prövningar14. Dessutom är mRNA som innehåller LNPs för närvarande ledande kandidater och har varit anställda för ett COVID-19-vaccin15,16. Den potentiella framgången för dessa icke-virala genterapier kräver att man bildar små (~ 100 nm), stabila och enhetliga partiklar med hög inkapsling av nukleinsyran.

Användning av en joniserbar lipid som huvudkomponent i LNP-formuleringen har visat fördelar för hy, inkapsling och leveranseffektivitet14. Joniserbara lipider har vanligtvis en syra dissociation konstant (pKa) < 7; till exempel har dilinoleylmetyl-4-dimetyllaminobutyrat (D-Lin-MC3-DMA), den joniserbara lipid som används i den FDA-godkända LNP-formuleringen, en pKa på 6,4417. Vid lågt pH blir aminegrupperna på joniserbara lipid protonerade och positivt laddade, vilket möjliggör montering med negativt laddade fosfatgrupper på mRNA och DNA. Förhållandet mellan amin, “N”, grupper till fosfat, “P”, grupper används för att optimera enheten. N/P-förhållandet är beroende av de lipider och nukleinsyror som används, vilket varierar beroende på formuleringen18. Efter bildandet kan pH-h justeras till ett neutralt eller fysiologiskt pH för att möjliggöra terapeutisk administrering. Vid dessa pH-värden avprotoneras också den joniserbara lipiden som ger neutral ytladdning till LNP.

Den joniserbara lipiden hjälper också till i endosomal flykt19,20. LNPs genomgår endocytos under cellulärt upptag och måste släppas ut från endomen för att leverera mRNA-lasten till cellcytoplasman eller DNA-lasten till kärnan21. Inuti endosomen är vanligtvis en surare miljö än det extracellulära mediet, vilket gör den joniserbara lipiden positivt laddad22,23. Den positivt laddade joniserbara lipiden kan interagera med negativa laddningar på det endosomala lipidmembranet, vilket kan orsaka destabilisering av endosomen som möjliggör frisättning av LNP och nukleinsyra. Olika joniserbara lipider studeras för närvarande för att förbättra effektiviteten av både LNP-distribution, liksom endosomal escape14.

Andra typiska komponenter i en LNP inkluderar hjälpare lipider, såsom en fosfatidylkolin (PC) eller fosfoethanolamine (PE) lipid. 1,2-Dioleoyl-sn -glycero-3-fosfoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) används ofta hjälpare lipider24,25. DOPE har visat sig bilda en inverterad sexkantig II (HII) fas och förbättra transfection av membran fusion26, medan DSPC har tänkts stabilisera LNPs med sin cylindriska geometri27. Kolesterol ingår också i formuleringen för att öka membranstelheten och därefter bidra till LNP: s stabilitet. Slutligen ingår lipidkonjugerad polyetylenglykol (PEG) i formuleringen för att ge den nödvändiga steriska barriären för att underlätta partikelns självmontering27. PEG förbättrar också lagringsstabiliteten hos LNP:er genom att förhindra aggregering. Dessutom används PEG ofta som en stealth-komponent och kan öka cirkulationstiden för LNPs. Detta attribut kan dock också innebära utmaningar för rekrytering av ache-adresser till hepatocyter genom en endogen målmekanism som drivs av apolipoprotein E (ApoE)28. Studier har således undersökt alamylkedjelängden för diffusion av PEG från LNP och funnit att korta längder (C8-14) avviker från LNP och är mer mottagliga för ApoE-rekrytering jämfört med längre ayllängder28. Vidare har graden av mättnad av lipidsvansen som PEG är konjugerad till visat sig påverka vävnadsfördelningen av LNPs29. Nyligen visade sig Tween 20, som är ett vanligt tensid i biologiska läkemedelsformuleringar och har en lång omättad lipidsvans, ha hög transfektion i dränerande lymfkörtlar jämfört med PEG-DSPE, som till stor del transfekterade muskeln vid injektionsstället29. Denna parameter kan optimeras för att uppnå önskad LNP-biodistribution.

Konventionella metoder för att bilda LNPs inkluderar tunnfilmshydreringsmetoden och etanolinjektionsmetoden27. Även om dessa är lättillgängliga tekniker, är de också arbetsintensiva, kan resultera i låg inkapslingseffektivitet och är utmanande att skala upp27. Framsteg inom blandningsteknik har resulterat i metoder som är mer mottagliga för att skala upp, samtidigt som mer enhetliga partiklar27. Dessa metoder inkluderar T-junction blandning, förskjutna fiskben blandning och mikrofluidic hydrodynamiskafokusering 27. Varje metod har en unik struktur, men alla möjliggör snabb blandning av en vattenfas som innehåller nukleinsyran med en organisk fas som innehåller lipidkomponenterna, vilket resulterar i hög inkapsling av nukleinsyran27. I detta protokoll används snabb och kontrollerad blandning genom en mikrofluidisk patron, som använder den förskjutna fiskbensblandningsdesignen. Det här protokollet beskriver förberedelse, sammansättning och karakterisering av nukleinsyra som innehåller LNPs.

Protocol

Ett schema över den övergripande processen finns i figur 1. 1. Utarbetande av buffertar OBS: Steril filtrering av buffertarna föreslås här starkt för att ta bort eventuella partiklar som kan påverka nukleinsyran och LNP-kvaliteten. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) Förbered 1x PBS med 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl och 2,7 mM KCl i nukleasfritt vatten och juster…

Representative Results

Flera partier av LNPs med samma lipid formulering och N/P förhållandet 6 utvecklades på separata dagar för att visa reproducerbarhet av tekniken. Parti 1 och 2 resulterade i överlappande storleksfördelningar med liknande polydispersitet(figur 2A)Ingen signifikant skillnad observerades i storleks- eller inkapslingseffektiviteten mellan de två olika partier(figur 2B). Inkapslingseffektiviteten var hög för varje sats (>98,5…

Discussion

Reproducerbarhet, hastighet och lågvolymscreening är betydande fördelar med att använda mikrofluidblandning för att bilda LNPs jämfört med andra befintliga metoder (t.ex. lipidfilmhydrering och etanolinjektion). Vi har visat reproducerbarheten av denna metod utan inverkan på inkapsling effektivitet eller partikel storlek observeras med olika LNP partier. Detta är ett viktigt kriterium för att alla terapeutiska, inklusive LNPs, ska bli kliniskt tillgängliga.

Tekniken som beskrivs hä…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tack till Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger och Philip Zakas för deras vägledning och bidrag till LNP:s utveckling.

Materials

1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

Riferimenti

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
check_url/it/62226?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

View Video