Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen

Published: February 7, 2021 doi: 10.3791/62234
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,3,4
1Department of Materials Science & Engineering, Stanford University, 2Department of Chemical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Pediatrics - Endocrinology, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de synthese en formulering van injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogel biomaterialen. Toepassingen van deze materialen voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering worden gedemonstreerd.

Abstract

Deze methoden beschrijven hoe injecteerbare, supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogels kunnen worden geformuleerd voor gebruik als biomaterialen. PNP-hydrogels bestaan uit twee componenten: hydrofoob gemodificeerde cellulose als netwerkpolymeer en zelfgeassembleerde kernschilnanodeeltjes die fungeren als niet-covalente dwarsdoorsneden door dynamische, multivalente interacties. Deze methoden beschrijven zowel de vorming van deze zelfgeassembleerde nanodeeltjes door nanoprecipitatie als de formulering en het mengen van de twee componenten om hydrogels met afstembare mechanische eigenschappen te vormen. Het gebruik van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en reologie om de kwaliteit van de gesynthetiseerde materialen te karakteriseren is ook gedetailleerd. Ten slotte wordt het nut van deze hydrogels voor medicijnafgifte, biofarmaceutische stabilisatie en celencapsulatie en -levering aangetoond door middel van in vitro experimenten om medicijnafgifte, thermische stabiliteit en celbezinking en levensvatbaarheid te karakteriseren. Vanwege de biocompatibiliteit, injecteerbaarheid en milde gelvormingsomstandigheden is dit hydrogelsysteem een gemakkelijk afstembaar platform dat geschikt is voor een reeks biomedische toepassingen.

Introduction

Injecteerbare hydrogels zijn een opkomend hulpmiddel om therapeutische cellen en medicijnen op een gecontroleerde manier aan het lichaam te leveren1. Deze materialen kunnen worden geladen met medicijnen of cellen en kunnen op een minimaal invasieve manier worden toegediend door directe injectie op oppervlakkige weefsels of door katheterafgifte aan diepe weefsels. Over het algemeen bestaan injecteerbare hydrogels uit watergezwollen polymeernetwerken die met elkaar verbonden zijn door voorbijgaande, fysieke interacties. In rust zorgen deze crosslinks voor een vaste structuur aan de gels, maar bij toepassing van voldoende mechanische kracht worden deze crosslinks tijdelijk verstoord, waardoor het materiaal wordt omgezet in een vloeistofachtige toestand die gemakkelijk kan stromen2. Het zijn deze reologische eigenschappen die het mogelijk maken fysieke hydrogels te dun te scheren en door kleine naalddiameters te stromen tijdens injectie3. Na injectie herstelt het polymeernetwerk van het materiaal, waardoor het zichzelf kan genezen en snel een vaste gel kan vormen in situ4,5. Deze structuren kunnen fungeren als langzaam vrijkomende depots voor geneesmiddelen of steigers voor weefselregeneratie6,7. Deze materialen zijn gebruikt in diverse toepassingen die drugleveringstechnologie, regeneratieve geneeskunde, en immunoengineering1,8,9,10,11,12omvatten.

Zowel natuurlijke materialen (bijv. alginaat en collageen) als synthetische materialen (bv. poly(ethyleenglycol) (PEG) of soortgelijke hydrofiele polymeren) zijn ontwikkeld als biocompatibel injecteerbare hydrogelmaterialen13,14,15. Veel natuurlijke materialen vertonen batch-to-batch variatie die de reproduceerbaarheid beïnvloedt4,16. Deze materialen zijn vaak temperatuurgevoelig en genezen bij het bereiken van fysiologische temperaturen; het hanteren van deze materialen brengt dus extra technische en logistieke uitdagingen met zich mee17. Synthetische materialen zorgen voor een nauwkeurigere chemische controle en een uitstekende reproduceerbaarheid, maar deze materialen kunnen soms worden blootgesteld aan negatieve immuunresponsen die hun biocompatibiliteit beperken, een cruciaal kenmerk voor in vivo therapeutische toepassingen6,18,19. Recente inspanningen hebben aangetoond dat er veel complexe ontwerpcriteria zijn betrokken bij het ontwerpen van een injecteerbaar hydrogelmateriaal, waaronder het optimaliseren van mechanische eigenschappen, maaswijdte van het polymeernetwerk, bioactieve moleculaire signalen, biologische afbreekbaarheid en immunogeniciteit van het materiaal20,21,22,23,24,25,26. Al deze factoren moeten worden overwogen afhankelijk van de toepassing van interesse, wat betekent dat een modulair, chemisch afstembaar platform ideaal is om aan een breed scala aan toepassingen te voldoen.

De huidige methoden beschrijven de formulering en het gebruik van een injecteerbaar polymeer-nanodeeltje (PNP) hydrogelplatform dat afstembare mechanische eigenschappen, een hoge mate van biocompatibiliteit en lage immunogeniciteit vertoont en locaties presenteert voor het vervoegen van bioactieve moleculaire signalen27,28,29,30,31,32,33. Deze PNP-hydrogels zijn samengesteld uit hydrofobe gemodificeerde cellulosepolymeren en zelfgeassembleerde kernschilnanodeeltjes bestaande uit poly(ethyleenglycol)- blok-poly(melkzuur) (PEG-PLA)27,34 die interageren om een supramoleculair netwerk te produceren. Meer in het bijzonder werken de dodecyl-gemodificeerde hydroxypropylmethylcellulosepolymeren (HPMC-C12) dynamisch samen met het oppervlak van PEG-PLA nanodeeltjes en overbruggen ze tussen deze nanodeeltjes om dit polymeernetwerk te vormen27,34. Deze dynamische, multivalente interacties zorgen ervoor dat de materialen tijdens de injectie dunner worden en na toediening snel zelf genezen. De PNP-hydrogelcomponenten kunnen eenvoudig worden vervaardigd door eenvoudige eenpotreacties en de PNP-hydrogel wordt onder milde omstandigheden gevormd door eenvoudige menging van de twee componenten35. Door het fabricagegemak is dit hydrogel platform zeer vertaalbaar op schaal. De mechanische eigenschappen en maaswijdte van PNP-hydrogels worden gecontroleerd door het gewichtspercentage van de polymeer- en nanodeeltjescomponenten in de formulering te wijzigen. Eerdere studies met dit platform geven aan dat PNP-hydrogels zeer biocompatibel, biologisch afbreekbaar en niet-immunogeen28,30,31zijn . Over het algemeen bieden deze hydrogels een breed nut in biomedische toepassingen, waaronder postoperatieve hechtingspreventie, weefseltechnologie en regeneratie, aanhoudende medicijnafgifte en immunoengineering.

Protocol

Voordat met dit protocol wordt begonnen, is het noodzakelijk HPMC-C12 en PEG-PLA te synthetiseren met behulp van eerder gepubliceerde methoden27,28,29,30,31,36,37,38.

1. Nanodeeltjessynthese (NP) door nanoprecipitatie

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de synthese van één batch NPs, die 250 μL van 20 wt% NPs produceert in bufferoplossing (50 mg droog PEG-PLA polymeer per batch). Opmerkingen voor het opschalen van het aantal batches worden bij relevante stappen verstrekt.

  1. Meet 50 mg PEG-PLA polymeer in een glazen scintillatieflacon van 8 ml en voeg 1 ml acetonitril toe. Vortex om volledig op te lossen.
    OPMERKING: Om het aantal batches op te schalen, schaalt u deze stap lineair en voegt u de totale hoeveelheid polymeer en oplosmiddel toe die nodig is in één flacon.
  2. Voeg 10 ml ultrapure water toe aan een glazen scintillatieflacon van 20 ml met een kleine roerstaaf. Zet op een roerplaat ingesteld op 600 tpm.
    OPMERKING: Als stap 1.1 is geschaald, is het nog steeds noodzakelijk om voor elke gelijkwaardige batch een individuele scintillatieflacon te hebben om in te precipitaat. Bereid bijvoorbeeld voor 200 mg polymeer opgelost in 4 ml acetonitril 4 x 20 ml scintillatiefons.
  3. Om NPs te vormen door nanoprecipitatie, voegt u 1 ml polymeeroplosmiddeloplossing druppelgewijs toe aan het water met behulp van een pipet van 200 μL. Roer gedurende 2 minuten. Het PLA-blok van de PEG-PLA is niet oplosbaar in water, en als gevolg daarvan zullen core-shell NPs zichzelf assembleren met de hydrofobe PLA-blokken als de kern en de hydrofiele PEG-blokken als de schaal.
  4. Controleer de deeltjesgrootte door dynamische lichtverstrooiing (DLS).
    OPMERKING: Deze procedure is specifiek geschreven voor een in de handel verkrijgde plaatlezer met het bijbehorende softwarepakket (zie materiaaltabel). Raadpleeg voor het gebruik van alternatieve instrumenten de door de fabrikant van het instrument beschreven monstervoorbereidingsmethoden.
    1. Verdun 20 μL NP-oplossing met 80 μL ultrapure water (analyseconcentratie: 1 mg/ml PEG-PLA NP's). Voeg 30 μL per put toe aan een heldere bodemzwarte 384-putplaat (analyseren in drievoud).
    2. Meet de hydrodynamische radius en polydispersiteit van elk monster met een DLS-plaatlezer met behulp van vooraf ingestelde protocolopties in het softwarepakket. Als voorbeeld van een typisch protocol stelt u de parameters voor gegevensverzameling in om 5-10 DLS-metingen van 2-5 s duur per verwerving te verkrijgen en rapporteert u vervolgens een gemiddelde deeltjesgrootte en -verdeling per put, berekend op basis van het bolvormige eiwitmodel. Om hydrogels met consistente rheologische eigenschappen te vormen, moeten de resulterende deeltjes 30-50 nm in hydrodynamische diameter zijn met een polydispersiteit (PD) < 0,2.
      OPMERKING: Als de NPs kleiner zijn dan gewenst, gebruik dan een oplossing van 75% acetonitril / 25% dimethylsulfoxide (DMSO) in stap 1.1. Het verhogen van het percentage DMSO in de oplosmiddeloplossing zal over het algemeen de deeltjesgrootte vergroten.
  5. Breng de NP-oplossing van de scintillatieflacon van 20 ml over in een centrifugaalfiltereenheid. Centrifugeer gedurende 1 uur op 4500 x g om de NP-oplossing te concentreren op < 250 μL.
  6. Resuspend in de gewenste buffer, zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), tot 20 wt% NPs. Pipetteer de inhoud van de centrifugaalfiltereenheid in een geteerde microcentrifugebuis of glazen scintillatieflacon op een massabalans. Gebruik een kleine hoeveelheid (50-100 μL) buffer om het filter te spoelen en ervoor te zorgen dat alle NPs worden opverzameling. Voeg buffer toe om een totale massa van 250 mg te bereiken.
    OPMERKING: Batches kunnen worden samengevoegd tijdens resuspensie. NP-voorraadoplossingen kunnen ongeveer 1 maand bij 4 °C worden bewaard. Niet bevriezen. Controleer voor langere opslag de grootte en polydispersiteit door DLS voor gebruik.

2. Hydrogelformulering en inkapseling van geneesmiddelen of cellen

OPMERKING: Deze sectie beschrijft de bereiding van 1 ml 2:10 PNP hydrogelformulering, met 2:10 die 2 wt% HPMC-C12 en 10 wt% NPs (12 wt% totaal vast polymeer) en 88 wt% bufferoplossing, drugladingsoplossing of celsuspensie aanduidt. De formuleringspercentages kunnen worden gevarieerd om hydrogels met een reeks mechanische eigenschappen op te leveren. Bijvoorbeeld, 1:5 PNP hydrogels werden gebruikt voor de cel bezinking en levensvatbaarheid experimentele resultaten getoond.

  1. Bereid voorraadoplossing voor van 6 wt% HPMC-C12 in PBS (of een andere buffer naar keuze). Los gedurende 48 uur op om ervoor te zorgen dat het polymeer volledig is gedispergeerd.
    OPMERKING: De HPMC-C12 voorraadoplossing is maandenlang stabiel bij kamertemperatuur. Opslag bij 4 °C wordt echter aanbevolen om microbiële groei te remmen.
  2. Voeg 333 mg 6 wt% HPMC-C12 stamoplossing toe aan een luerslotspuit van 1 ml.
  3. Voeg 500 μL 20 wt% NP-voorraadoplossing toe aan een microcentrifugebuis. Voeg 167 μL PBS en pipet toe om te mengen. Vul met een naald nog een luerslotspuit van 1 ml met de verdunde NP-oplossing.
    OPMERKING: Om de lading van het geneesmiddel te laden, berekent u de gewenste eindconcentratie van het geneesmiddel in de hydrogel en laadt u de juiste hoeveelheid in de 167 μL PBS die met de NPs wordt gemengd. Als een moleculaire sonde nodig is voor een in situ test, zoals voor het bewaken van de stabiliteit van het geneesmiddel, laadt u de sonde op een vergelijkbare manier als hierboven beschreven voor het laden van drugslading. Om cellen te laden, berekent u de gewenste uiteindelijke celconcentratie in de hydrogel en laadt u het juiste aantal cellen in de 167 μL PBS die wordt gemengd met de NPs.
  4. Meng de twee hydrogelcomponenten (HPMC-C12 en NPs) met behulp van een elleboogmengmethode35.
    1. Bevestig de Luer elleboogconnector aan de spuit met NP-oplossing (optioneel ook met medicijnlading of cellen). Duw de NP-oplossing door de elleboog totdat de meniscus zichtbaar is aan het open uiteinde. Trek iets terug en sluit de spuit met HPMC-C12-oplossing aan.
      OPMERKING: Het is belangrijk om lucht in de elleboogverbinding te minimaliseren om de vorming en verspreiding van bellen door de hydrogel tijdens het mengproces te voorkomen. Wanneer u cellen mengt met de elleboogmixer, zorg er dan voor dat u voorzichtiger mengt, omdat te snel mengen de cellen kan onderwerpen aan hoge afschuifkrachten, wat leidt tot celdood.
    2. Pomp de twee oplossingen ongeveer 60 cycli heen en weer door de elleboogmixer totdat zich een homogeen, ondoorzichtig wit hydrogelmateriaal heeft gevormd.
    3. Duw het hele volume hydrogel in één spuit. Verwijder de lege spuit en trek de zuiger terug op de met gel geladen spuit om materiaal van de elleboogconnector terug te winnen. Dop met een naald of plug.
      OPMERKING: Het is noodzakelijk om rekening te houden met ~ 300 μL verloren hydrogelvolume als gevolg van de dode ruimte in het mengproces. Als bijvoorbeeld 700 μL eindhydrogelvolume gewenst is, moet 1 ml hydrogel worden bereid. Het hydrogelformuleringsproces kan worden opgeschaald met behulp van grotere spuiten. Voor stijve hydrogelformuleringen, zoals 2:10, kan het echter moeilijk worden om te mengen en te injecteren uit spuiten groter dan 3 ml in volume vanwege de toenemende verhouding tussen spuitvat en elleboog of naalddiameter.
    4. Bewaar de hydrogel in de spuit bij kamertemperatuur. Als geneesmiddelen echter zijn ingekapseld, wordt opslag bij 4 °C aanbevolen, tenzij de fabrikant van het geneesmiddel anders aangeeft. Vries het materiaal niet in.

3. Het meten van reologische eigenschappen van hydrogelformuleringen

OPMERKING: Dit protocol wordt specifiek gebruikt met de commerciële rheometer vermeld in de tabel met materialen met een 20 mm gekartelde plaatgeometrie. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor de monstervoorbereiding voor het gebruik van andere instrumenten.

  1. Formuleer ten minste 700 μL PNP-hydrogel voor reologische karakterisering.
  2. Injecteer materiaal in het midden van de gekartelde rheometerplaat. De hoeveelheid is afhankelijk van de gekozen geometriekloof. Ter referentie, een opening van 700 μm vereist ~ 400-500 μL materiaal.
  3. Laat de rheometer zakken tot de trimspleet (500-1000 μm) en draai langzaam de bovenste rheometerplaat terwijl deze contact maakt met de PNP-hydrogel om ervoor te zorgen dat de opening gelijkmatig en volledig wordt gevuld.
  4. Controleer de belasting van de PNP-hydrogel zodanig dat deze het gehele oppervlak van de rheometerplaat bedekt. Gebruik een spatel of plastic trimmer om overtollig materiaal voorzichtig te trimmen en te verwijderen, zodat het een zeer lichte uitstulping uit de plaat heeft.
  5. Laat de rheometer zakken tot de uiteindelijke geometriekloof en controleer of het monster netjes is geladen.
  6. Meet de mechanische eigenschappen van het monster met behulp van oscillatietests, zoals amplitude- of frequentievegen, of stroomtests, zoals stroomvegen of staptests.
    OPMERKING: In de getoonde representatieve gegevens worden oscillatoire amplitudetests uitgevoerd met een constante frequentie van 10 rad/s. Oscillatoire frequentie sweeps worden uitgevoerd bij een constante 1% stam, binnen het lineaire visco-elastische regime van de amplitude sweep. Flow sweeps werden uitgevoerd van hoge afschuifsnelheden naar lage afschuifsnelheden39. Alle tests worden afgerond met 10 punten per decennium aan verzamelde gegevens en bij kamertemperatuur. De testparameters moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de eigenschappen van de formulering. Het onderwerpen van stijvere PNP-materialen zoals 2:10-formuleringen aan hoge afschuifsnelheden kan ertoe leiden dat het materiaal uit de rheometerplaten wordt geworpen, wat resulteert in onnauwkeurige mechanische karakterisering en het opnieuw laden van het monster tussen de volgende tests vereist. Representatieve gegevens die hieronder worden weergegeven, kunnen worden gebruikt voor vergelijking tijdens kwaliteitscontroletests.

4. Karakteriseren van in vitro medicijnafgifte

  1. Bereid capillaire buizen voor door glazen capillaire buizen op de gewenste lengte te snijden. Sluit het ene uiteinde van elke buis af met behulp van een wegwerpspatel of pipettip om een kleine hoeveelheid epoxy in het uiteinde van de buis te duwen om een plug te vormen. Laat epoxy instellen per aanbevolen tijd van de fabrikant.
    OPMERKING: De buis moet korter zijn dan de lengte van de injectienaald. Buizen met een binnendiameter van 2-3 μm worden zodanig aanbevolen dat een lengte van 2,5 inch ten minste 300 μL van het totale volume bevat.
  2. Formuleer ten minste 500 μL van een PNP-hydrogelmateriaal in een spuit die het geneesmiddel van belang bevat. Bereid elke monstergroep voor in een aparte spuit.
  3. Injecteer 100-200 μL van de PNP-hydrogel aan de onderkant van elke capillaire buis met behulp van een lange injectienaald (22G, 4 inch). Bereid ten minste drie buisjes (drievoud) per monstergroep.
  4. (Optioneel) Plaats gevulde capillaire buizen in een conische centrifugebuis en centrifugeer gedurende 1 min bij 1000 x g om ervoor te zorgen dat het oppervlak van de hydrogel gelijkmatig is. Deze stap moet mogelijk worden herhaald, waarbij de tijd en snelheid zo nodig worden gewijzigd om het oppervlak van het materiaal glad te strijken.
    LET OP: Zorg ervoor dat de centrifuge goed in balans is.
  5. Vul voorzichtig 200-300 μL PBS bovenop de hydrogel in de capillaire buis met een spuit en naald of pipet. Neem het oppervlak van de hydrogel niet in contact of verstoor het niet. Sluit de buis af met een dop of plug of deksel met ten minste twee lagen paraffinefilm.
  6. (Optioneel) Incubeer monsters bij 37 °C om in vivo omstandigheden te simuleren.
  7. Verwijder de PBS voorzichtig volledig uit elk capillair, zonder het hydrogeloppervlak te verstoren, met behulp van een spuit en naald op de gekozen tijdstippen, afhankelijk van de verwachte tijdschaal van het vrijkomen van geneesmiddelen. Vervang het verwijderde volume door verse PBS. Bewaar aliquots onder de juiste omstandigheden.
    OPMERKING: De aanbevolen volumes en tijdspunten in stap 4.3, 4.5 en 4.7 kunnen worden geoptimaliseerd om de afgifte van in vitro geneesmiddelen over een reeks tijdschalen vast te leggen, afhankelijk van hoeveel geneesmiddel in het materiaal wordt geladen en hoe snel het in het supernatant vrijkomt. Een steekproef van geselecteerde tijdspunten kan 6 uur, 1 dag, 3 dagen, 1 week en 2 weken zijn voor een langzaam vrijgevend medicijn. Aliquots kunnen ook worden geanalyseerd als ze worden verworven in plaats van opgeslagen.
  8. Analyseer aan het einde van het onderzoek aliquots met een geschikte methode zoals ELISA, HPLC of fluorescentietest om de hoeveelheid geneesmiddel te kwantificeren die telkens op punt40,41,42vrijkomt . De juiste detectiemethode zal variëren, afhankelijk van het geneesmiddel van belang.
    OPMERKING: In vitro release studies zijn nuttig voor het vergelijken van afgifte tussen verschillende hydrogel formuleringen of drug lading. De in vitro release timescale geeft vaak niet direct een verwachte tijdschaal van release in vivo aan.

5. Kenmerkende thermische stabiliteit van gel-ingekapselde insuline

  1. Formuleer ten minste 1,2 ml PNP-hydrogel per monstergroep. Volgens de procedure beschreven in rubriek 2.3, zowel insuline (medicijnlading) als thioflavine T (ThT) (moleculaire sonde) in de PNP-hydrogel laden.
    OPMERKING: Het primaire aggregatiemechanisme en dus de inactivatie van insuline is door de vorming van amyloïde fibrils. ThT is een geschikte moleculaire sonde omdat het een sterk fluorescentiesignaal produceert in aanwezigheid van amyloïde fibrils, waardoor in situ monitoring van insulineaggregatie mogelijk is. Afhankelijk van de drugslading van belang, kan de aggregatie op verschillende manieren worden gecontroleerd. Voor de getoonde representatieve gegevens werd insuline geladen tot een eindconcentratie van 6,7 of 10 mg/ml en ThT tot een eindconcentratie van 25 μM.
  2. Injecteer met een naald van 21 G 200 μL PNP-hydrogel per put in een zwarte plaat met 96 put. Elke steekproefgroep moet ten minste in drievoud worden gemeten. Afdichtingsplaat met een optisch heldere plakplaatafdichting om verdamping te voorkomen.
  3. Plaats de plaat in een plaatlezer die is uitgerust met temperatuurregeling, schudden en kinetische leesprogrammering en begin met het leesprotocol. Representatieve gegevens werden verkregen met een in de handel verkrijgde plaatlezer (zie materiaaltabel) onder de volgende voorwaarden:
    1. Gestreste verouderingsomstandigheden: continu lineair schudden (410 cpm, 5 mm) bij 37 °C.
    2. Gegevensverwerving: excitatie/emissie 450 nm/482 nm met intervallen van 20 min
      OPMERKING: Als er geen plaatlezer met temperatuurregeling, schudmachine en kinetische leesmogelijkheden beschikbaar is, kan de plaat op een schudplaat in een incubator worden geplaatst en handmatig op boven de golflengten op geselecteerde tijdspunten worden gelezen.
  4. Plot gegevens als gemiddeld fluorescentiesignaal in de loop van de tijd voor elke groep. Tijd tot aggregatie kan worden gekwantificeerd door een willekeurige signaaldrempel43te definiëren .
    OPMERKING: Voor de onderstaande representatieve gegevens werd de drempelwaarde gedefinieerd als 750.000 willekeurige fluorescentie-eenheden (AFU). Deze waarde werd gekozen om boven de gemeten basislijn te liggen, terwijl het begin van de aggregatie nog steeds voldoende werd vastgelegd, aangegeven door een sterke toename van het fluorescerende signaal.
  5. Beëindig de test wanneer monsters aggregaat of visueel beginnen te uitdrogen.

6. Beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen

  1. Formuleer ten minste 2 ml PNP-hydrogel met de gewenste celconcentratie volgens bovenstaande protocollen (normaal 1 - 5 x 106 cellen/ml). Bereid elke monstergroep voor in een aparte spuit.
  2. Injecteer met een 21G-naald 150 μL PNP-hydrogel in elke put in een heldere bodemplaat van 96 wells; elke put is één replica. Elke steekproefgroep moet 3-5 replicates per tijdspunt hebben. Centrifugeer de plaat 2 minuten op 50 x g om de hydrogel gelijkmatig in de put te verspreiden.
  3. Voeg 100 μL van de juiste celmedia toe bovenop de hydrogel. Verwijder dit medium elke dag en voeg 100 μL nieuwe media toe.
  4. Verwijder op dag 1 de media bovenop de hydrogel voor de aangewezen replica's voor dat tijdstip voor elke monstergroep. Voeg 50 μL 2 mM calceïne AM-oplossing toe bovenop de hydrogels. Incubeer gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Calceïne AM kan worden gebruikt om levende cellen te identificeren en te labelen. In levende cellen wordt de niet-fluorescerende calceïne AM omgezet in een groen-fluorescerend calceïne, door intracellulaire esterasen na acetoxymethylesterhydrolyse.
  5. Beeld het midden van elke put in een 96-put plaat met behulp van een confocale microscoop. Onderzoek een gebied van ten minste 300 μm2 met een z-stack van ten minste 150 μm. Gebruik confocale golflengte-instellingen om de fluorescentie van calceïne vast te leggen (excitatie/emissie: 495 nm/515 nm).
  6. Herhaal stap 6.4 en 6.5 voor elk volgend tijdspunt naar wens.
  7. Als u elke afbeelding wilt analyseren, vouwt u alle z-stack-afbeeldingen samen in één afbeelding met maximale intensiteit van één vlak met fiji of vergelijkbare software. Kwantificeer het aantal fluorescerende cellen in elke afbeelding. De verhouding van het aantal fluorescerende cellen op elk moment ten opzichte van het aantal fluorescerende cellen op dag 1 is de relatieve levensvatbaarheid van de cellen in de PNP-hydrogels.

7. Celbezinking beoordelen

  1. Bereken het aantal cellen dat nodig is om 500-700 μL PNP-hydrogel te formuleren bij een eindconcentratie van 5 x 106 cellen/ml. S hang cellen op in 1 ml PBS bij een concentratie van 1 x 106 cellen/ml. Vlekcellen door toevoeging van 50 μL calceïne AM van 2 mM. Incubeer de cellen met de kleurstof gedurende 10 minuten.
  2. Centrifugeer cellen onder de juiste omstandigheden, verwijder het PBS en resuspend de cellen in het volume PBS dat nodig is om 500-700 μL van de gewenste PNP-hydrogel te vormen.
    OPMERKING: De aanbevolen snelheid en duur om elk specifiek celtype te centrifugeren, staat meestal in de productdocumentatie.
  3. Formuleer 500-700 μL PNP-hydrogel met de bevlekte cellen (5 x 106 cellen/ml) volgens protocolsectie 2.
  4. Injecteer met een 21G-naald 100-200 μL PNP-hydrogel met de bevlekte cellen in de bodem van een cuvette. Voor elk monster moeten drie replicaties worden uitgevoerd. Beweeg de naald heen en weer in de cuvette tijdens het injecteren om bellenvorming te voorkomen.
  5. Stel onmiddellijk (tijd t=0) de cuvetten in beeld die op hun kant liggen over het hele vlakke cuvette-rechthoekgebied aan de basis van de cuvette. Gebruik de mogelijkheden voor het scannen van confocale tegels om het hele putgebied in beeld te brengen en een z-stack in 3D over een diepte van 100 μm af te beelden. Voor latere visualisatie gebruikt u de confocale microscoopsoftware om alle afzonderlijke tegels aan elkaar te naaien en een projectie met maximale intensiteit uit te voeren om een enkel beeld van het grote gebied te vormen of fiji-software te gebruiken op een personal computer44,45.
  6. Na beeldvorming, zet de cuvettes rechtop.
  7. Afbeelding om 1 uur en 4 uur om te zien of cellen zich in de hydrogel hebben gevestigd of dat ze blijven hangen.
    OPMERKING: Deze tijdspunten zijn suggesties en kunnen naar wens worden gewijzigd.
  8. Als u elke afbeelding wilt analyseren, vouwt u alle z-stack-afbeeldingen samen in één afbeelding met maximale intensiteit van één vlak. Kwantificeer met FIJI of vergelijkbare software de celverdeling door de fluorescentie-intensiteit in het verticale middenprofiel van de cuvette te meten om de mate van bezinking te bepalen.

Representative Results

PNP hydrogel fabricage en karakterisering
PNP-hydrogels worden gevormd door het mengen van de twee primaire componenten - hydrofobe gemodificeerde HPMC-polymeren en PEG-PLA-nanodeeltjes (figuur 1a). Therapeutische lading kan het gemakkelijkst worden opgenomen in de extra buffer die wordt gebruikt om de nanodeeltjescomponent te verdunnen voorafgaand aan hydrogelpreparaat. Voor downstream biomedische karakterisering is het handig om een elleboogmengmethode te gebruiken die eenvoudige en reproduceerbare menging van de twee componenten mogelijk maakt (figuur 1b). Na voldoende mengen moet de hydrogel stevig aanvoelen in de spuit, maar onder druk produceren en extruderen uit een standaardnaald (21G afgebeeld) (figuur 1c). Na injectie moet de hydrogel snel worden omgezet in een vast materiaal dat bestand is tegen de zwaartekracht. Om de hydrogel volledig te karakteriseren en consistente batch-to-batch-producten te garanderen, moeten monsters worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimenten op een rheometer. De shear-thinning en zelfgenezend vermogen van de gel zal gemakkelijk worden waargenomen met behulp van een flow sweep protocol en step-shear protocol, respectievelijk(figuur 2a,b). Voor stijvere gels, zoals de 2:10-formulering, moet de gebruiker op zoek gaan naar viscositeit om ten minste twee ordes van grootte te verminderen tijdens de stroomveeg, omdat de afschuifsnelheid wordt verhoogd van 0,1 tot 100 s-1, wat de mechanische omstandigheden tijdens de injectie simuleert. Het step-shear protocol moet een orde-van-grootte afname van de viscositeit onder de high-shear stappen onthullen, en een snelle terugkeer (<5 s hersteltijd) naar baseline viscositeit tijdens de lage afschuifstappen. Karakterisering van de opslag- en verliesmoduli met behulp van een oscillatoire afschuiffrequentieveegexperiment in het lineaire visco-elastische regime moet solide eigenschappen onthullen bij frequentiebereiken van 0,1-100 rad s-1 (Figuur 2c). In het bijzonder mag er meestal geen cross-over van de afschuifopslag en verliesmoduli zijn die waarneembaar is bij lage frequenties voor stijvere formuleringen zoals de 2:10 hydrogels. Een dergelijke crossover-gebeurtenis kan wijzen op problemen in de kwaliteit van de uitgangsmaterialen, hetzij het gemodificeerde HPMC- of PEG-PLA-polymeer, hetzij de grootte en dispersie van de PEG-PLA-nanodeeltjes. Opgemerkt moet worden dat een crossover-gebeurtenis kan worden verwacht voor zwakkere hydrogelformuleringen, zoals de 1:5 hydrogel. Oscillatoire schuifamplitudes op PNP-hydrogels laten zien dat de materialen pas opbrengen als hoge spanningswaarden zijn toegepast, wat aangeeft dat deze materialen een opbrengstspanning hebben, een drempelhoeveelheid stress die nodig is om het materiaal te laten stromen.

Kenmerkende releasekinetiek van PNP hydrogels
Een essentiële stap in het ontwerpen van PNP-gels voor medicijnafgifte is de karakterisering van kinetiek van medicijnafgifte uit een gekozen formulering. Hiervoor zijn verschillende technieken, maar een eenvoudige in vitro methodologie levert nuttige gegevens op tijdens de vroege ontwikkeling van formuleringen (figuur 3a). Het variëren van het polymeergehalte van de PNP-hydrogels door het moduleren van de hoeveelheid HPMC-C12 of NPs is de meest eenvoudige manier om de mechanische eigenschappen en maaswijdte van deze hydrogels af te stemmen, wat een directe invloed kan hebben op de diffusie van lading door het polymeernetwerk en de snelheid van afgifte uit de materialen (figuur 3b). Voor lading die groter is dan de dynamische maaswijdte (d.w.z. hoog moleculair gewicht of grote hydrodynamische straal), moeten onderzoekers een langzame, oplossingsgemedieerde afgifte van lading uit het hydrogeldepot verwachten. Formuleringen met dynamische maaswijdten groter dan of gelijk aan de grootte van de lading maken diffusiegemedieerde vrijgave mogelijk die kan worden beschreven met behulp van traditionele modellen van ladingdiffusie en vrijgave46,47,48,49. Op basis van de vorm van de releasecurve kunnen onderzoekers de hydrogel herformuleren om deze langzamer af te stemmen (bijv. het polymeergehalte verhogen) of sneller (bijv. het polymeergehalte verlagen).

Beoordeling van de stabiliteit van therapeutische lading
Het bepalen van de stabiliteit van de therapeutische lading in een hydrogelformulering is van cruciaal belang voordat wordt beginnen met preklinische of cellulaire studies. In vergelijking met andere synthetische methoden voor het inkapselen van drugs, nemen PNP-hydrogels lading op een zachte manier op door zich in het bulkmateriaal te mengen, en het is onwaarschijnlijk dat inkapseling de lading zal beschadigen. Deze studies tonen aan dat PNP-hydrogels ook lading kunnen stabiliseren die gevoelig is voor thermische instabiliteit, zoals insuline, waardoor de houdbaarheid aanzienlijk wordt verlengd en de afhankelijkheid van koude opslag en distributie wordt verminderd (figuur 4). Het is belangrijk om de toestand van de lading onmiddellijk na inkapseling in de hydrogel en na langere opslagperioden te evalueren. Deze gegevens tonen aan dat insuline stabiel blijft in hydrogels na 28 dagen opslag onder continue thermische en mechanische stress, met behulp van een eenvoudige fluorescentietest voor het meten van insulineaggregatie. Een alternatieve techniek voor gevallen waarin een geschikte plaattest niet beschikbaar is, zou zijn om circulaire dichroïsmemetingen van de lading uit te voeren, wat met name nuttig is voor het bepalen van de secundaire structuur van eiwitgeneesmiddelen.

Bepalen van cel levensvatbaarheid en dispersie in PNP hydrogels
Veel therapeutische cellen vereisen hechtingsmotieven om levensvatbaar te blijven, en dus is het opnemen van integrinmotieven zoals arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) peptiden een belangrijke stap in het aanpassen van PNP-hydrogels voor cellulaire therapieën50. Het modulaire PEG-PLA polymeer bestaande uit de NPs maakt chemische functionalisering van de PEG corona mogelijk door middel van eenvoudige "click" chemie28,51. In dit voorbeeld werden cellijme RGD-peptiden bevestigd aan het PEG-PLA-polymeer om celbetrokkenheid met de PNP-hydrogelstructuur te bevorderen. Formuleringen zonder hechtingsplaatsen zullen een lage levensvatbaarheid van cellen hebben, aangezien ingekapselde cellen zich niet verspreiden in vergelijking met cellen die zijn ingekapseld in formuleringen met deze adhesiemotieven (figuur 5a, b). Ingekapselde cellen kunnen worden gelabeld met calceïne AM of een andere geschikte fluorescerende kleurstof (bijv. CFSE) om het tellen van cellen met een fluorescentiemicroscoop te vergemakkelijken. Tijdens optimalisatie moet de levensvatbaarheid worden vergeleken met ongewijzigde PNP-hydrogels om ervoor te zorgen dat integrin-gefunctionaliseerde formuleringen zorgen voor een verbeterde levensvatbaarheid en proliferatie. Als integrin-gefunctionaliseerde formuleringen vergelijkbare werkzaamheid bieden als ongewijzigde hydrogels, kan dit wijzen op een falen in de vervoegingschemie die wordt gebruikt om de hechtingsmotieven op te nemen.

Onderzoekers moeten verwachten dat ingekapselde cellen gelijkmatig worden verspreid door het hydrogelmedium bij gebruik van een geschikte hydrogelformulering. Dit maakt een consistente en voorspelbare dosering van cellen tijdens de toediening van hydrogel mogelijk en moet zich vertalen in lokale retentie van cellen in de hydrogel na toediening. De verdeling van cellen kan eenvoudig worden bepaald met behulp van fluorescentiemicroscopietechnieken. Cellen kunnen worden gelabeld met een geschikte kleurstof en vervolgens worden afgebeeld met confocale microscopie. De beelden kunnen visueel (figuur 5c) en ook kwantitatief (figuur 5d) worden beoordeeld met behulp van ImageJ-software om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit langs de verticale as van het beeld te meten (of langs welke as celbezinking als gevolg van de zwaartekracht wordt verwacht). Als de hydrogelformulering te zwak is om de cellen gedurende langere tijd in suspensie te ondersteunen, zal celbezinking optreden, zoals waargenomen in de 1:1-formulering in figuur 5. Het verhogen van het polymeergehalte kan problemen met inhomogene celdispersie als gevolg van vestiging oplossen.

Figure 1
Figuur 1: Polymeer-nanodeeltjes (PNP) hydrogels kunnen gemakkelijk worden gevormd door twee componenten te mengen. (a) De eerste component is een oplossing van dodecyl-gemodificeerde hydroxypropylmethylcellulose (HPMC-C12), en de tweede component is een oplossing van poly(ethyleenglycol)-blok-poly (melkzuur) (PEG-PLA) nanodeeltjes samen met elke therapeutische lading. Zachte menging van deze twee componenten levert een injecteerbare hydrogel op, waarbij de HPMC-C12 polymeren fysiek worden gekruist door dynamische, multivalente interacties met de PEG-PLA nanodeeltjes. (b) Foto die gelformulering demonstreert door te mengen met twee spuiten, elk met één component van de PNP-hydrogel. Door de twee spuiten aan te sluiten op een Luer-lock elleboogconnector, kunnen de twee componenten gemakkelijk worden gemengd onder steriele omstandigheden om een bubbelvrije hydrogel te produceren die vooraf in een spuit is geladen voor onmiddellijk gebruik. De NP-oplossing is blauw geverfd voor demonstratie. c) Demonstratie van de injectie van PNP-hydrogels en de restolling daarvan. i) PNP-hydrogel in een spuit met een bijgevoegde 21G-naald. ii) Injectie plaatst de hydrogel onder afschuiving die tijdelijk de interacties tussen polymeer en nanodeeltjes breekt, waardoor een vloeistofachtige consistentie ontstaat. (iii) Na de injectie veranderen de dynamische polymeer-nanodeeltjes interacties snel, waardoor de hydrogel zichzelf kan genezen tot een vaste stof. iv) De vaste hydrogel stroomt niet onder krachten die zwakker zijn dan de opbrengstspanning, zoals zwaartekracht. De PNP hydrogel is blauw geverfd ten behoeve van demonstratie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Rheologische karakterisering van twee PNP hydrogelformuleringen. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. (a) De constante afschuifstroom veegt van lage naar hoge afschuifsnelheid van PNP-hydrogels. Viscositeit als functie van afschuifsnelheid kenmerkt afschuifverdunnende eigenschappen. (b) Viscositeit als functie van oscillerende afschuifsnelheden tussen lage afschuifsnelheden (witte achtergrond; 0,1 s−1) tot hoge afschuifsnelheden (rode achtergrond; 10 s−1) die zelfherstellende eigenschappen van PNP-hydrogels aantonen. Afschuiftarieven worden opgelegd voor 30 s per stuk. (c) Elastische opslagmodulus G′ en viskeuze verliesmodulus G" als functie van de frequentie bij een constante stam van 1% voor verschillende PNP-hydrogelformuleringen. (d) Amplitude veegt met een constante frequentie van 10 rad/s om elastische opslagmodulus G′ en viskeuze verliesmodulus G" van PNP-hydrogels te karakteriseren als functie van stress. Deze reologische karakterisering kan worden gebruikt als vergelijking voor kwaliteitscontrole. Dit cijfer is aangepast van Grosskopf et al.28Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: In vitro afgifte van runderserumalbumine (BSA) uit PNP-hydrogels. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. a) Schematisch beschrijven van het experimentele protocol voor in-vitro-afgifte. Aliquots worden na verloop van tijd uit PNP hydrogel-geladen capillaire buizen verwijderd. b)de in-vitro-afgifte van BSA van 1:10 PNP, 2:5 PNP en 2:10 PNP gerapporteerd als de massa die wordt verzameld door het opgegeven tijdstip gedeeld door de totale massa die tijdens de test is verzameld (gegevens die worden weergegeven als gemiddelde ± SD; n = 3). BSA werd gedetecteerd door absorptiemetingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Thermische stabiliteit van insuline ingekapseld in PNP-hydrogels door ThT-test. Formuleringen worden aangeduid als polymeer wt.%: NP wt.%. Insuline ingekapseld in zowel 1:5 als 2:10 PNP hydrogel bleef gedurende meer dan 28 dagen niet samengevoegd bij stressverouderingscondities van 37 °C en constante agitatie. De tijd tot aggregatie voor insuline geformuleerd in PBS was 20 ± 4 uur (gemiddelde ± SD, aggregatiedrempel 750.000 AFU). Gegevens gepresenteerd als gemiddeld n = 4 experimentele replica's (AFU, willekeurige fluorescentie-eenheden). Deze figuur is aangepast van Meis et al.38Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Levensvatbaarheid van cellen en celbezinking in PNP-hydrogels. (a,b) Cel levensvatbaarheidsstudies in PNP-hydrogels met menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC's). a) Representatieve afbeeldingen van levensvatbare hMSC's in 1:5 PNP-hydrogels met en zonder het cellijme arginine-glycine-asparaginezuur (RGD) motief vervoegd met de PEG-PLA NPs. hMSC's werden gedurende 30 minuten vóór confocale beeldvorming calceïnebeitst. Schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. (b) Levensvatbaarheid van cellen op dag 6 gedefinieerd als aantal fluorescerende cellen in de afbeelding ten opzichte van het aantal fluorescerende cellen op dag 1 (gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD; n = 3). c,d) Cel inkapseling en het regelen van experimenten met hMSC's. (c) Beelden met maximale intensiteit van calceine AM-bevlekte hMSC's ingekapseld in 1:1 PNP hydrogel (bovenste rij) en 1:5 PNP hydrogel (onderste rij) gedurende 4 uur om celbezinking te kwantificeren. Schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. (d) Gemiddelde horizontale pixelintensiteit van hMSC's langs het verticale profiel van de hydrogel. Dit cijfer is aangepast van Grosskopf et al.28Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Polymer-Nanoparticle (PNP) hydrogels zijn gemakkelijk te fabriceren en maken de langdurige lokale levering van therapeutische cellen en geneesmiddelen mogelijk door minimaal invasieve toediening via directe injectie of katheterafgifte. Deze protocollen beschrijven de formulering van PNP-hydrogels en de karakteriseringsmethoden om de kwaliteit van de resulterende materialen te garanderen. Supramoleculaire PNP-hydrogels zijn schaalbaar om te produceren en worden gevormd door het eenvoudig mengen van gemodificeerde cellulosepolymeren en polymere kernschilnanodeeltjes. De huidige methoden beschrijven facile procedures om gels te vormen die vooraf in spuiten zijn geladen door middel van eenvoudige elleboogmengprotocollen. Door middel van kwaliteitscontrolestatistieken van elk van de componenten, zoals DLS om de NP-grootte en -distributie te bewaken, kan men PNP-hydrogelmaterialen met consistente rheologische eigenschappen reproduceerbaar formuleren. Door de hoeveelheid HPMC-C12 of NPs te variëren, kan men de maaswijdte en stijfheid van de resulterende PNP-hydrogel moduleren. Deze eigenschappen kunnen worden afgestemd op het beste passen bij een bepaalde biomedische toepassing, en met de hier beschreven reologische methoden kunnen onderzoekers de afschuifverdunnende en zelfherstellende eigenschappen van PNP-hydrogels karakteriseren terwijl ze het platform optimaliseren voor hun specifieke toepassingen. Methoden voor in vitro release studies worden ook beschreven; onderzoekers kunnen deze studies gebruiken om de relatieve tijdschaal van afgifte van geneesmiddelen van belang te karakteriseren, waardoor toekomstige in vivo studies worden geïnformeerd. Met behulp van stabiliteitsstudies kunnen onderzoekers ook het vermogen van deze materialen beoordelen om de biologische structuur en stabiliteit van gevoelige biotherapeutica in de loop van de tijd en extreme temperaturen te helpen behouden, met overtuigende potentiële toepassingen om de afhankelijkheid van biotherapeutica in de koudeketen te verminderen. Ten slotte kunnen met eenvoudige cel levensvatbaarheidstesten celgroei en migratie binnen PNP-materialen worden geëvalueerd, met potentiële toepassingen in celtherapieën en steigers.

Onze groep heeft veel aantrekkelijke toepassingen gevonden voor het PNP hydrogel platform27. PNP-hydrogels zijn gebruikt voor langzame toediening van subeenheidvaccins, waardoor overeenkomende kinetische afgifteprofielen van antigenen en hulpstoffen de grootte, duur en kwaliteit van de humorale immuunrespons kunnen verhogen31. PNP-hydrogels blijken een kleinere maaswijdte te hebben dan de meest gebruikte hydrogels, dus ze zijn effectief in het vertragen van diffusie en het langzaam vrijgeven van moleculaire lading. De unieke weefselaanhechtingseigenschappen en mechanische eigenschappen van PNP-hydrogels zijn ook gebruikt om fysieke barrières te vormen om verklevingen als gevolg van chirurgie te voorkomen door de hydrogels na een operatie over grote oppervlakten van organen te spuiten30. PNP-hydrogels zijn ook effectief gebleken bij het leveren van cellen, en de mechanische eigenschappen beschermen cellen eigenlijk tegen de mechanische krachten die tijdens de injectie in de spuitnaald optreden, waardoor de levensvatbaarheid van de cellen wordt verbeterd29. Wanneer de NPs worden geconjugeerd met een celklevend peptide, kunnen cellen zich hechten en zich bezighouden met de PNP-matrix om levensvatbaar te blijven. Met behulp van deze aanpak is aangetoond dat PNP-hydrogels de lokale retentie van geïnjecteerde stamcellen verbeteren in vergelijking met methoden met vloeibare voertuigen28. Bovendien is aangetoond dat PNP-hydrogels thermisch geïnduceerde aggregatie van ingekapselde insuline voorkomen, zelfs onder zware stressomstandigheden, wat suggereert dat deze materialen de noodzaak om temperatuurgevoelige geneesmiddelen te koelen kunnen verminderen38.

Over het algemeen zullen de hier beschreven methodologieën onderzoeksgroepen in staat stellen PNP-hydrogels als biomateriaal te fabriceren en te verkennen. Deze protocollen bieden de synthesetechnieken op laboratoriumschaal om voldoende hydrogelmateriaal te fabriceren om zowel in vitro als in vivo studies uit te voeren. De hierboven beschreven studies geven aan dat de dynamische dwarskoppelingen van deze materialen het mogelijk maken om geschikt te zijn voor een reeks biomedische toepassingen door actieve beweeglijkheid van ingesloten cellen mogelijk te maken en tegelijkertijd passieve diffusie van moleculaire lading te beperken. Verwacht wordt dat onderzoekers het PNP-platform een toegankelijk en krachtig instrument zullen vinden om klinische resultaten te verbeteren door gecontroleerde medicijnafgifte en om fundamentele biologische mechanismen zoals celwerving en mechanobiologie te bestuderen.

Disclosures

Deze auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd financieel ondersteund door het Center for Human Systems Immunology met Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1113682) en de Bill &Melinda Gates Foundation (OPP1211043). C.M.M. werd ondersteund door een Stanford Graduate Fellowship en de Stanford Bio-X William and Lynda Steere Fellowship. A.K.G. is dankbaar voor een National Science Foundation Graduate Research Fellowship en de Gabilan Fellowship van de Stanford Graduate Fellowship in Science and Engineering. S.C. werd ondersteund door het National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder awardnummer F32CA247352. De auteurs willen ook appellableden, waaronder Dr. Gillie Roth, Dr. Anthony Yu, Dr. Lyndsay Stapleton, Dr. Hector Lopez Hernandez, Dr. Andrea d'Aquino, Dr. Julie Baillet, Celine Liong, Ben Ou, Emily Meany, Emily Gale en Dr. Anton Smith, hartelijk erkennen voor hun inspanningen en tijd om het Appel Lab te helpen deze protocollen door de jaren heen te ontwikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21G needles BD 305165 PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles Air-Tite N224 In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom Corning 3540 Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black Fisher Scientific 07-200-627 Biostability studies
96-well plates, clear Corning 3599 Cell viability and settling studies
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Cell viability and settling studies
Capillary tubes McMaster-Carr 8729K66 In vitro release studies
Centrifugal filter units Fisher Scientific UFC901024 NP concentration
Cuvettes Millipore Sigma BR759015-100EA Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader Wyatt Technology DynaPro II Plate Reader Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy VWR International 300007-392 (EA) In vitro release studies
Hypodermic needles Air-Tite 8300015027 In vitro release studies
Luer elbow connector Cole-Parmer EW-30800-12 PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe Fisher Scientific 14-955-456 PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher Scientific 10010049 PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula Thomas Scientific 1229F13 Rheological characterization
Plate Reader BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader Biostability studies
Plate seals Excel Scientific TS-RT2-100 Biostability studies
Recombinant human insulin Gibco A11382II Biostability studies
Rheometer TA Instruments DHR-2 Rheometer Rheological characterization
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G Biostability studies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandal, A., Clegg, J. R., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Hydrogels in the clinic. Bioengineering Translational Medicine. 5 (2), 10158 (2020).
  2. Appel, E. A., del Barrio, J., Loh, X. J., Scherman, O. A. Supramolecular polymeric hydrogels. Chemical Society Reviews. 41 (18), 6195-6214 (2012).
  3. Mann, J. L., Yu, A. C., Agmon, G., Appel, E. A. Supramolecular polymeric biomaterials. Biomaterials Science. 6 (1), 10-37 (2018).
  4. Foster, A. A., Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. The diverse roles of hydrogel mechanics in injectable stem cell transplantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 15, 15-23 (2017).
  5. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  6. Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. Design of injectable materials to improve stem cell transplantation. Current Stem Cell Reports. 2 (3), 207-220 (2016).
  7. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Current Opinion in Biotechnology. 24 (5), 841-846 (2013).
  8. Marquardt, L. M., et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy. Science Advances. 6 (14), 1039 (2020).
  9. Stephan, S. B., et al. Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nature Biotechnology. 33 (1), 97-101 (2015).
  10. Tuladhar, A., et al. Injectable hydrogel enables local and sustained co-delivery to the brain: two clinically approved biomolecules, cyclosporine and erythropoietin, accelerate functional recovery in rat model of stroke. Biomaterials. 235, 119794 (2020).
  11. Pakulska, M. M., Miersch, S., Shoichet, M. S. Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science. 351 (6279), (2016).
  12. Gupta, D., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials. 27 (11), 2370-2379 (2006).
  13. Verbeke, C. S., Mooney, D. J. Injectable, pore-forming hydrogels for in vivo enrichment of immature dendritic cells. Advanced Healthcare Materials. 4 (17), 2677-2687 (2015).
  14. Tous, E., Purcell, B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Injectable acellular hydrogels for cardiac repair. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (5), 528-542 (2011).
  15. Zhao, X., et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 122, 34-47 (2017).
  16. Johnson, T. D., Christman, K. L. Injectable hydrogel therapies and their delivery strategies for treating myocardial infarction. Expert Opinion on Drug Delivery. 10 (1), 59-72 (2013).
  17. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Seminars in Cancer Biology. , Elsevier. 378-386 (2005).
  18. Hickey, J. W., et al. Engineering an artificial T-cell stimulating matrix for immunotherapy. Advanced Materials. 31 (23), 1807359 (2019).
  19. Baumann, M. D., et al. An injectable drug delivery platform for sustained combination therapy. Journal of Controlled Release. 138 (3), 205-213 (2009).
  20. Trappmann, B., et al. Matrix degradability controls multicellularity of 3D cell migration. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  21. Figueiredo, L., et al. Assessing glucose and oxygen diffusion in hydrogels for the rational design of 3D stem cell scaffolds in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (5), 1238-1246 (2018).
  22. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. , 1-24 (2019).
  23. Chaudhuri, O., et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  24. Cai, L., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Injectable hydrogels with in situ double network formation enhance retention of transplanted stem cells. Advanced Functional Materials. 25 (9), 1344-1351 (2015).
  25. Fisher, S. A., Baker, A. E., Shoichet, M. S. Designing peptide and protein modified hydrogels: selecting the optimal conjugation strategy. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7416-7427 (2017).
  26. Li, R. H., Altreuter, D. H., Gentile, F. T. Transport characterization of hydrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnology and Bioengineering. 50 (4), 365-373 (1996).
  27. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6 (6295), (2015).
  28. Grosskopf, A. K., et al. Injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels enhance human mesenchymal stem cell delivery. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (1), 10147 (2020).
  29. Lopez Hernandez, H., Grosskopf, A. K., Stapleton, L. M., Agmon, G., Appel, E. A. Non-newtonian polymer-nanoparticle hydrogels enhance cell viability during injection. Macromolecular Bioscience. 19 (1), (2019).
  30. Stapleton, L. M., et al. Use of a supramolecular polymeric hydrogel as an effective post-operative pericardial adhesion barrier. Nature Biomedical Engineering. 3 (8), 611-620 (2019).
  31. Roth, G. A., et al. Injectable hydrogels for sustained codelivery of subunit vaccines enhance humoral immunity. ACS Central Science. , (2020).
  32. Steele, A. N., et al. A biocompatible therapeutic catheter-deliverable hydrogel for in situ tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), 1801147 (2019).
  33. Fenton, O. S., et al. Injectable polymer-nanoparticle hydrogels for local immune cell recruitment. Biomacromolecules. 20 (12), 4430-4436 (2019).
  34. Yu, A. C., Smith, A. A., Appel, E. A. Structural considerations for physical hydrogels based on polymer-nanoparticle interactions. Molecular Systems Design & Engineering. 5 (1), 401-407 (2020).
  35. Wisdom, K., Chaudhuri, O. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Koledova, Z. , Springer. New York. 29-37 (2017).
  36. Lohmeijer, B. G., et al. Guanidine and amidine organocatalysts for ring-opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39 (25), 8574-8583 (2006).
  37. Cheng, J., et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials. 28 (5), 869-876 (2007).
  38. Meis, C. M., et al. Self-assembled, dilution-responsive hydrogels for enhanced thermal stability of insulin biopharmaceuticals. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2020).
  39. Franck, A., Germany, T. Viscoelasticity and dynamic mechanical testing. TA Instruments. , New Castle, DE, USA. AN004 (1993).
  40. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6, 6295 (2015).
  41. Gallastegui, A., et al. Controlled release of antibiotics from photopolymerized hydrogels: kinetics and microbiological studies. Materials Science and Engineering: C. 102, 896-905 (2019).
  42. Qiao, M., Chen, D., Ma, X., Liu, Y. Injectable biodegradable temperature-responsive PLGA-PEG-PLGA copolymers: synthesis and effect of copolymer composition on the drug release from the copolymer-based hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 294 (1-2), 103-112 (2005).
  43. Schlein, M. Insulin Formulation Characterization-The Thioflavin T Assays. The AAPS Journal. 19 (2), 397-408 (2017).
  44. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  45. Sakas, G., Grimm, M., Savopoulos, A. EUROGRAPHICS workshop on Rendering Techniques. , Springer. 51-63 (1995).
  46. Axpe, E., et al. A multiscale model for solute diffusion in hydrogels. Macromolecules. 52 (18), 6889-6897 (2019).
  47. Peppas, N., Bures, P., Leobandung, W., Ichikawa, H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 50 (1), 27-46 (2000).
  48. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5 (1), 23-36 (1987).
  49. Reinhart, C. T., Peppas, N. A. Solute diffusion in swollen membranes. Part II. Influence of crosslinking on diffusive properties. Journal of Membrane Science. 18, 227-239 (1984).
  50. Salinas, C. N., Anseth, K. S. The influence of the RGD peptide motif and its contextual presentation in PEG gels on human mesenchymal stem cell viability. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 2 (5), 296-304 (2008).
  51. Smith, A. A., et al. Nanoparticles presenting potent TLR7/8 agonists enhance anti-PD-L1 immunotherapy in cancer treatment. Biomacromolecules. 21 (9), 3704-3712 (2020).

Tags

Bioengineering medicijnafgifte celinkapseling biomaterialen hydrogels biofarmaceutica
Injecteerbare supramoleculaire polymeer-nanodeeltjes hydrogels voor cel- en medicijnafgiftetoepassingen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meis, C. M., Grosskopf, A. K.,… More

Meis, C. M., Grosskopf, A. K., Correa, S., Appel, E. A. Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications. J. Vis. Exp. (168), e62234, doi:10.3791/62234 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter