Этот протокол описывает хирургические и технические процедуры, которые позволяют в режиме реального времени in vivo многофотонную флуоресцентную визуализацию мозга грызунов во время сфокусированного ультразвука и микропузырьков для повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера.
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является ключевой проблемой для успешной доставки лекарств в мозг. Ультразвуковое воздействие в присутствии микропузырьков стало эффективным методом временного и локального повышения проницаемости ГЭБ, облегчая пара- и трансклеточный транспорт лекарств через ГЭБ. Визуализация сосудистой системы во время ультразвуково-микропузырного лечения даст ценную и новую информацию о механизмах и динамике ультразвуково-микропузырьковых процедур в головном мозге.
Здесь мы представляем экспериментальную процедуру прижизненной многофотонной микроскопии с использованием краниального окна, выровненного с кольцевым преобразователем и объективом 20x. Эта настройка позволяет получать изображения мозга с высоким пространственным и временным разрешением во время ультразвуково-микропузырьковых процедур. Оптический доступ к мозгу осуществляется через черепно-мозговое окно с открытым черепом. Вкратце, кусок черепа диаметром 3-4 мм удаляется, а открытая область мозга запечатывается стеклянной крышкой. Кольцевой преобразователь 0,82 МГц, который прикреплен ко второму стеклянному чехлу, установлен сверху. Агароза (1% мас./об.) используется между крышкой датчика и крышкой, покрывающей краниальное окно, для предотвращения пузырьков воздуха, которые препятствуют распространению ультразвука. Когда проводятся стерильные хирургические процедуры и противовоспалительные меры, ультразвуково-микропузырьковые процедуры и сеансы визуализации могут выполняться повторно в течение нескольких недель. Флуоресцентные конъюгаты декстрана вводят внутривенно для визуализации сосудистой системы и количественной оценки ультразвуковых микропузырьковых эффектов (например, кинетика утечки, сосудистые изменения). В этой статье описывается размещение краниального окна, размещение кольцевого преобразователя, процедура визуализации, общие этапы устранения неполадок, а также преимущества и ограничения метода.
Ключевой проблемой для лечения неврологических расстройств является наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ГЭБ ограничивает попадание гидрофильных, заряженных, полярных и крупных (> 400 Да) молекул в паренхиму мозга1. Одним из методов, используемых в настоящее время для доставки терапевтических средств через ГЭБ в паренхиму мозга, является использование стереотаксических внутричерепных инъекций2. Другие менее инвазивные исследуемые методы затруднены сложностью используемых методов, таких как разработка лекарств для опосредованной рецепторами доставки через ГЭБ3, или ограничены в пространственной точности целевых областей, таких как интраназальные инъекции4 или введение гиперосмотических растворов5.
Использование ультразвука в сочетании с системно вводимыми микропузырьками, ультразвуковым контрастным веществом, было разработано в качестве неинвазивного средства для временного повышения проницаемости ГЭБ6. Используя сфокусированный преобразователь7 или управляемую фазированную решетку преобразователей8,9, ультразвук может быть нацелен на выбранные области мозга с точностью до миллиметрового уровня, сводя к минимуму нецелевые эффекты. Ультразвуковые микропузырьковые процедуры могут быть настроены на анатомию мозга каждого субъекта с использованием магнитно-резонансной томографии 7,10,11,12,13,14 или стереотаксических кадров15. Кроме того, степень увеличения проницаемости ГЭБ можно контролировать в режиме реального времени путем мониторинга акустического излучения от микропузырьков16,17,18. Клинические испытания, изучающие безопасность и осуществимость ультразвуково-микропузырьковых методов лечения, в настоящее время проводятся во всем мире (например, ClinicalTrials.gov идентификатор NCT04118764).
Ультразвуковые микропузырьковые методы лечения ГЭБ обычно оцениваются путем подтверждения вызванного лечением увеличения проницаемости ГЭБ, визуализируется в магнитно-резонансной томографии с контрастным усилением или путем экстравазации красителя в визуализации in vivo или гистологии ex vivo. Тем не менее, большинство микроскопических анализов были выполнены ex vivo после завершения ультразвуковой микропузырьковой обработки11,19, что привело к отсутствию динамических биологических реакций во время и сразу после ультразвукового воздействия. Визуализация в режиме реального времени, проводимая во время ультразвукового воздействия, может помочь в понимании механизмов, приводящих к лечению ультразвукового микропузырька ГЭБ, а также последующих реакций, что может улучшить наше понимание его терапевтического применения. Кроме того, использование хронических черепных окон с методами визуализации in vivo позволит продольным исследованиям оценить временные аспекты ультразвуково-микропузырьковых процедур.
Целью данного протокола является описание хирургических и технических процедур, необходимых для проведения многофотонной визуализации ультразвукового микропузырькового лечения в режиме реального времени для острых и хронических исследований на грызунах (рисунок 1). Это достигается в двух частях: во-первых, для создания краниального окна для обеспечения визуализации in vivo, а во-вторых, для установки кольцевого преобразователя сверху для обеспечения одновременной обработки ультразвуком и визуализации. Черепные окна широко используются нейробиологами для визуализации in vivo нейроваскулярной связи20, β-амилоидного патогенеза21 и нейроиммунологии22, среди прочих. В этом протоколе описаны хирургические процедуры создания острых (невосстановительных) и хронических (восстановительных) черепных окон в черепе мыши и крысы. Методологии краниальных окон, особенно для хронических экспериментов, были хорошо задокументированы23,24,25. В соответствии с существующей литературой термины «острый» и «хронический» будут использоваться во всем этом протоколе. Конструкция кольцевых преобразователей для визуализации in vivo также была ранее описана26. Несмотря на доступность этих методов и понимание, которое может быть получено из визуализации в режиме реального времени ультразвуковых микропузырьковых методов лечения, существует очень мало исследовательских лабораторий, которые успешно опубликовали литературу с использованием этого метода26,27,28,29,30,31,32 . Таким образом, в этом протоколе описываются хирургические и технические детали проведения этих ультразвуковых микропузырьковых экспериментов в режиме реального времени. В то время как указанные параметры обработки ультразвуком и визуализации были оптимизированы для экспериментов с ГЭБ, другие эффекты ультразвукового воздействия на мозг, такие как нейромодуляция33,34, мониторинг β-амилоидных бляшек31 и реакции иммунных клеток32, также могут быть исследованы с использованием этого метода.
Мониторинг прижизненной многофотонной микроскопии головного мозга является ценным инструментом для изучения реакций мозга во время ультразвукового воздействия. Насколько нам известно, описанный здесь протокол является единственным методом проведения многофотонной микроскопической визуализации паренхимы головного мозга во время ультразвуково-микропузырьковых процедур. Создание краниальных окон и использование кольцевых преобразователей позволяют в режиме реального времени контролировать сосудистые, клеточные и другие последующие реакции на ультразвуковые микропузырьковые процедуры с высоким пространственным и временным разрешением. Другие группы выполнили многофотонную микроскопическую визуализацию после завершения ультразвуково-микропузырьковых процедур, тем самым пропуская реакцию паренхимы головного мозга в реальном времени на лечение19. Описанная процедура предлагает улучшенный временной контроль, позволяя собирать данные, которые могут помочь осветить острые механизмы, лежащие в основе ультразвукового микропузырькового лечения. Количественные и качественные данные могут быть извлечены и проанализированы из стеков полученных изображений, таких как кинетика экстравазации27,29,30, изменения объема β-амилоидной бляшки31 и динамика клеток32.
В протоколе было выделено несколько шагов по устранению неполадок. Во-первых, были подчеркнуты хирургические этапы, которые особенно подвержены ошибкам оператора, такие как использование агарозы во время операции на черепном окне и размещение датчика. Также были предложены меры по предотвращению дискомфорта и смерти животных, включая мониторинг физиологии животных во время операции и тщательное вихрь декстрана перед инъекцией. Во-вторых, были также выделены физические характеристики преобразователя и выравнивание объектива, преобразователя и краниального окна. Технические характеристики кольцевого преобразователя и его акустические свойства должны определяться с учетом используемой линзы объектива, а также животной модели. В частности, внутренний диаметр кольцевого преобразователя должен быть достаточно большим, чтобы окружать объектив, но достаточно маленьким, чтобы надежно закрепиться на черепе животного. Кроме того, фокусная область преобразователя должна совпадать с диапазоном используемой объектива.
Общая проблема заключается в том, что краниальное окно и кольцевой преобразователь расположены под углом относительно объектива. Правильное центрирование (XY) и выравнивание (Z) объектива с краниальным окном и преобразователем гарантирует, что фокальная область преобразователя и, следовательно, область обработанной ткани мозга выравнивается с полем зрения изображения и снижает риск столкновения между объективом и преобразователем во время визуализации. Выравнивание может быть достигнуто путем регулировки положения головы животного и/или путем вращения стереотаксической рамки, в которой оно зафиксировано.
Компоненты микроскопа (например, детекторы, светоделители) и параметры получения изображения должны быть выбраны на основе цели исследования. Здесь используется объектив с длинным фокусным расстоянием (> 2 мм) из-за наличия покровного(ых) и кольцевого преобразователя, расположенного между объективом и мозгом. Также рекомендуется вертикальный микроскоп, поскольку он дает больше пространства для маневрирования животного, особенно для экспериментов с мозгом. Для захвата кинетики ультразвуковой микропузырьки, вызванной утечкой внутрисосудистого красителя, благоприятно высокое временное разрешение, которое может быть достигнуто с помощью системы резонансного сканирования. Сочетание этого с высокочувствительной системой обнаружения, такой как детекторы фосфида арсенида галлия (GaAsP), также приведет к более благоприятным изображениям.
Представленная экспериментальная процедура имеет ряд ограничений. Во-первых, хирургическая процедура является довольно инвазивной и, как сообщается, вызывает воспаление45, хотя воспаление может быть сведено к минимуму46. Кроме того, иммунные реакции, вызванные операциями на черепных окнах, разрешались через 2-4 недели после операции23,24,25. Кроме того, процесс бурения, особенно когда он проводится с чрезмерной силой или скоростью, может привести к повреждению подлежащей ткани из-за генерации тепла, вибрации и давления. Также наблюдалось, что операции на краниальном окне и многофотонная визуализация влияют на температуру мозга47. Эти ограничения могут быть уменьшены в некоторой степени за счет тщательного создания нетронутых черепных окон, правильного восстановления животных с хроническими краниальными окнами и поддержания нормотермической температуры тела с использованием источника нагрева с обратной связью. Во-вторых, глубина изображения ограничена используемым микроскопом и объективом. Например, эффект ультразвукового микропузырького лечения в более глубоких структурах мозга, таких как гиппокамп, не может быть изучен без более инвазивных мер, таких как удаление вышележащей кортикальной ткани48 или использование микролинз в сочетании с кортикальным проникновением49. Использование объектива с большим рабочим расстоянием может в некоторой степени решить эту проблему, но проникновение света также ограничено на больших глубинах.
В то время как репрезентативные изображения этого протокола были получены от грызунов дикого типа, представленная экспериментальная процедура также может быть применена к трансгенным животным и моделям заболеваний, таким как болезнь Альцгеймера31. Ультразвуковые эксперименты, не связанные с модуляцией ГЭБ, такие как ультразвуковая нейромодуляция, также могут контролироваться с использованием этого протокола33,34. Другие возможные применения могут быть достигнуты путем использования различных настроек микроскопа или детектора, таких как сопряжение конфокального микроскопа со сверхскоростной камерой50. В то время как фотоотбеливание и фототоксичность сравнительно хуже в конфокальных микроскопах из-за большого объема возбуждения, сверхскоростная визуализация может позволить визуализировать капиллярные эндотелиальные клеточно-микропузырьковые взаимодействия головного мозга с высоким временным разрешением, что может дополнительно осветить механизмы, управляющие ультразвуковым микропузырьковым лечением BBB. В заключение, описанный протокол предоставляет метод мониторинга сосудистых и клеточных эффектов, индуцированных ультразвуковыми экспериментами с микропузырьками ГЭБ в режиме реального времени, предоставляя инструмент для дальнейшего определения механизмов, приводящих к этим методам лечения, а также освещая последующие реакции паренхимы мозга на ультразвуковые микропузырьковые процедуры.
The authors have nothing to disclose.
Содержание животных было обеспечено Центром сравнительной медицины (CoMed, NTNU). Рисунок 3 был создан в BioRender.com. Записью и редактированием видео занимался Пер Хеннинг, веб-мастер факультета естественных наук НТНУ. Проект финансировался Норвежским университетом науки и технологии (NTNU, Тронхейм, Норвегия), Исследовательским советом Норвегии (RCN 262228), Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (FDN 154272), Национальным институтом здравоохранения (R01 EB003268) и кафедрой целенаправленных ультразвуковых исследований Темерти в Центре медицинских наук Саннибрука.
Ring transducer placement | |||
Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
Animal preparation and drugs | |||
Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
Material and equipment for cranial window placement | |||
Alcohol swabs | BD | 326895 | |
Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
Multiphoton microscopy | |||
20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
Ultrasound treatment | |||
50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |