تقييم تفاعلات البروتين في الخلايا الحية مع انبعاث الحنق الحساس
Summary
يمكن استخدام نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين جزيئين من الفلوروفور لدراسة تفاعلات البروتين في الخلية الحية. هنا ، يتم توفير بروتوكول حول كيفية قياس FRET في الخلايا الحية عن طريق الكشف عن الانبعاث الحساس للمستقبل وإخماد جزيء المتبرع باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.
Abstract
نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هو نقل الطاقة بدون إشعاع من متبرع متحمس إلى جزيء متقبل ويعتمد على مسافة واتجاه الجزيئات بالإضافة إلى مدى التداخل بين انبعاث المانحين وأطياف امتصاص المستقبل. يسمح الحنق بدراسة تفاعل البروتينات في الخلية الحية بمرور الوقت وفي المقصورات تحت الخلوية المختلفة. تم وصف خوارزميات مختلفة قائمة على الشدة لقياس FRET باستخدام الفحص المجهري في الأدبيات. هنا ، يتم توفير بروتوكول وخوارزمية لتحديد كفاءة FRET بناء على قياس كل من الانبعاث الحساس للمتلقي وإخماد جزيء المتبرع. لا يتطلب القياس الكمي للفريت النسبي في الخلية الحية فقط تحديد الحديث المتبادل (الانسكاب الطيفي ، أو النزيف) للبروتينات الفلورية ولكن أيضا كفاءة الكشف عن الإعداد المجهري. ويفصل البروتوكول المقدم هنا كيفية تقييم هذه البارامترات الحاسمة.
Introduction
يسمح التحليل المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) بتقييم التفاعلات بين البروتينات في الخلايا الحية. يوفر معلومات مكانية وزمانية ، بما في ذلك معلومات حول مكان حدوث التفاعل في الخلية وفي أي مقصورة تحت خلوية وما إذا كان هذا التفاعل يتغير بمرور الوقت.
وضع ثيودور فورستر الأساس النظري ل FRET في عام 19481. FRET هو نقل للطاقة بدون إشعاع من متبرع متحمس إلى جزيء متقبل ويعتمد على مسافة الجزيئات والاتجاه النسبي لثنائيات أقطاب انتقالها بالإضافة إلى التداخل بين انبعاث المانحين وأطياف امتصاص المستقبل. يتناسب معدل نقل الطاقة عكسيا مع القوة السادسة لمسافة المتبرع والمستقبل. وبالتالي ، يمكن استخدام FRET لقياس القرب الجزيئي في حدود 1-10 نانومتر.
يتنافس FRET مع عمليات إزالة الإثارة الأخرى لجزيء المتبرع وينتج عنه ما يسمى بتبريد المانحين وانبعاث التحسس للمتقبل. تبريد المانحين هو تقليل عدد الفوتونات المانحة المنبعثة ، في حين أن الانبعاث الحساس هو زيادة في الفوتونات المستقبلة المنبعثة. تستخدم العديد من تحليلات FRET المجهرية قياسات شدة التألق ، بما في ذلك التبييض الضوئي المتقبل 2 ، أو التبييض الضوئي للمانح2 ، أو التبييض الضوئي الحساس بالحنق للمتقبل3.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي خطوة بخطوة وخوارزمية رياضية لتحديد FRET باستخدام تبريد المانحين والانبعاث المتقبل 4,5 ، وهي طريقة يشار إليها غالبا باسم FRET النسبي. تم نشر العديد من البروتوكولات حول كيفية تقريب الانبعاثات الحساسة ، وقليل منها حدد كفاءة FRET المطلقة6،7،8،9. يتطلب القياس الكمي لكفاءات FRET في الخلية الحية تحديد (i) الحديث المتبادل (الانسكاب الطيفي ، أو النزيف) للبروتينات الفلورية ، وكذلك (ii) كفاءة الكشف عن الإعداد المجهري. في حين يمكن تقييم الحديث المتبادل عن طريق تصوير الخلايا التي تعبر عن واحد فقط من الفلوروفورات ، فإن تقييم كفاءة الكشف النسبية لتألق المتبرع والمستقبل أكثر تعقيدا. يتطلب معرفة نسبة عدد جزيئات المانحين والمستقبلين على الأقل التي تؤدي إلى الإشارات المقاسة. ومع ذلك ، يختلف عدد الفلوروفورات المعبر عنها في الخلايا الحية من خلية إلى أخرى وهو غير معروف. يميز ما يسمى بعامل α قوة الإشارة النسبية من جزيء مانح ومتقبل واحد متحمس. تعد معرفة العامل شرطا أساسيا لقياسات FRET التناسبية الكمية في العينات ذات نسب جزيء المستقبل إلى المتبرع المتغيرة كما تمت مواجهتها أثناء تصوير الخلايا الحية باستخدام البروتينات الفلورية. يسمح استخدام بروتين اندماج 1 إلى 1 من المتبرع والمتلقي كمسبار معايرة بتحديد عامل α ويعمل أيضا كعنصر تحكم إيجابي. يتم التعبير عن هذا المسبار المقترن وراثيا بواسطة الخلايا بكميات إجمالية غير معروفة ولكن بكمية نسبية ثابتة ومعروفة من واحد إلى واحد. يحدد البروتوكول التالي كيفية بناء مسبار 1 إلى 1 وكيفية استخدامه لقياس كفاءة RET. يمكن العثور على جدول بيانات يتضمن جميع الصيغ في الملحق ويمكن استخدامه من قبل القراء لإدخال قياساتهم الخاصة في الأعمدة المعنية كما هو موضح أدناه.
بينما يستخدم البروتوكول زوج مانح / متقبل GFP-Cherry ، يمكن تنفيذ النهج المقدم مع أي زوج FRET آخر. يقدم الملف التكميلي 1 تفاصيل عن أزواج السماوي والأصفر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يفصل البروتوكول المقدم استخدام مسبار معايرة البروتين الفلوري المقترن وراثيا من واحد إلى واحد لقياس FRET باستخدام الكشف عن الانبعاث الحساس لمستقبل وتبريد جزيء المتبرع بواسطة المجهر متحد البؤر. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقييم تفاعلات البروتين في السياق الفسيولوجي للخلية الحية في مقصورات تحت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر خدمة تصوير علم الأعصاب في كلية الطب بجامعة ستانفورد على توفير المعدات والمساحة لهذا المشروع. تم دعم هذا البحث من خلال التمويل الداخلي لمعهد ستانفورد للسرطان وقسم الأورام النسائية في ستانفورد بالإضافة إلى GINOP-2.3.2-15-2016-00026 و GINOP-2.3.3-15-2016-00030 و NN129371 و ANN135107 من المكتب الوطني للبحث والتطوير والابتكار ، المجر.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
Riferimenti
- Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).
- Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
- Mekler, V. M. A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer. Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).
- Vamosi, G., et al. Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study. Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).
- Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).
- van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission. Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).
- Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Sciences. 4, 413 (2013).
- Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors. Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).
- Menaesse, A., et al. Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method. Cytometry Part A. , 24194 (2020).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173, 33-38 (1996).
- Nagy, P., et al. Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins. Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).
- Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).
- Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy. Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).
- Tron, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis. Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).
- Sebestyen, Z., et al. Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer. Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).
- Szaloki, N., et al. High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).
- McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity. Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).
- Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochimica. 45 (21), 6570-6580 (2006).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Scott, B. L., Hoppe, A. D. Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells. Science Reports. 5, 10270 (2015).
- Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it. Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).
- King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments. Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).
