Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET
Summary
Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) entre deux molécules de fluorophore peut être utilisé pour étudier les interactions protéiques dans la cellule vivante. Ici, un protocole est fourni sur la façon de mesurer FRET dans les cellules vivantes en détectant l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.
Abstract
Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est le transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance et de l’orientation des molécules ainsi que de l’étendue du chevauchement entre les spectres d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur. FRET permet d’étudier l’interaction des protéines dans la cellule vivante au fil du temps et dans différents compartiments subcellulaires. Différents algorithmes basés sur l’intensité pour mesurer FRET à l’aide de la microscopie ont été décrits dans la littérature. Ici, un protocole et un algorithme sont fournis pour quantifier l’efficacité FRET basée sur la mesure à la fois de l’émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe de la molécule donneuse. La quantification du FRET ratiométrique dans la cellule vivante nécessite non seulement la détermination de la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes, mais aussi l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Le protocole fourni ici détaille comment évaluer ces paramètres critiques.
Introduction
L’analyse par microscopie du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) permet d’évaluer les interactions entre les protéines dans les cellules vivantes. Il fournit des informations spatiales et temporelles, y compris des informations sur l’endroit de la cellule et dans quel compartiment subcellulaire l’interaction a lieu et si cette interaction change au fil du temps.
Theodor Förster a posé les bases théoriques du FRET en 19481. FRET est un transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance des molécules et de l’orientation relative de leurs dipôles de transition ainsi que du chevauchement entre les spectres d’émission donneuse et d’absorption accepteur. Le taux de transfert d’énergie est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance donneur-accepteur. Ainsi, FRET peut être utilisé pour mesurer la proximité moléculaire dans la gamme de 1-10 nm.
FRET entre en compétition avec d’autres processus de désexcitation de la molécule donneuse et entraîne l’émission dite de trempe du donneur et sensibilisée de l’accepteur. La trempe du donneur est une réduction du nombre de photons donneurs émis, tandis que l’émission sensibilisée est une augmentation des photons accepteurs émis. De nombreuses analyses microscopiques FRET utilisent des mesures d’intensité de fluorescence, y compris le photoblanchiment accepteur 2, le photoblanchiment donneur2 ou le photoblanchiment sensible au FRET de l’accepteur3.
Ici, un protocole expérimental étape par étape et un algorithme mathématique sont présentés pour quantifier FRET en utilisant la trempe du donneur et l’émission sensibilisée par accepteur4,5, une méthode souvent appelée FRET ratiométrique. De nombreux protocoles sur la façon d’approximer les émissions sensibilisées ont été publiés, peu ont quantifié l’efficacité absoluedu FRET 6,7,8,9. La quantification des rendements FRET dans la cellule vivante nécessite de déterminer (i) la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes et, également (ii) l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Alors que la diaphonie peut être évaluée en imageant des cellules exprimant un seul des fluorophores, l’évaluation de l’efficacité relative de détection de la fluorescence donneuse et acceptrice est plus compliquée. Elle nécessite de connaître au moins le rapport entre le nombre de molécules donneuses et acceptrices donnant lieu aux signaux mesurés. Le nombre de fluorophores exprimés dans les cellules vivantes varie cependant d’une cellule à l’autre et est inconnu. Le facteur dit α caractérise les forces relatives du signal d’une seule molécule donneuse et acceptrice excitée. La connaissance du facteur est une condition préalable aux mesures quantitatives ratiométriques FRET dans des échantillons présentant des rapports de molécules accepteur/donneur variables, comme lors de l’imagerie de cellules vivantes avec des protéines fluorescentes. L’utilisation d’une protéine de fusion donneur-accepteur 1 pour 1 comme sonde d’étalonnage permet de déterminer le facteur α et sert également de contrôle positif. Cette sonde génétiquement couplée est exprimée par des cellules en quantités totales inconnues, mais dans une quantité relative fixe et connue de un à un. Le protocole suivant explique comment construire la sonde 1-to-1 et comment l’utiliser pour quantifier l’efficacité FRET. Une feuille de calcul qui comprend toutes les formules peut être trouvée dans le supplément et peut être utilisée par les lecteurs pour entrer leurs propres mesures dans les colonnes respectives comme indiqué ci-dessous.
Bien que le protocole utilise la paire donneur / accepteur GFP-Cherry, l’approche présentée peut être réalisée avec n’importe quelle autre paire FRET. Le dossier supplémentaire 1 fournit des détails sur les paires cyan-jaune.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté détaille l’utilisation de la sonde d’étalonnage de protéines fluorescentes un à un génétiquement couplé pour quantifier FRET en utilisant la détection de l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer les interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante dans différents compartiments subcellulaires. La résolution spatiale peut être encore amé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le service d’imagerie en neurosciences de la faculté de médecine de l’Université de Stanford pour avoir fourni l’équipement et l’espace nécessaires à ce projet. Cette recherche a été financée par le financement intra-muros du Stanford Cancer Institute et de la Gynecologic Oncology Division Stanford, ainsi que par GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 du Bureau national de recherche, de développement et d’innovation, Hongrie.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Clontech mCherry N1 vector | Addgene | 3553 | |
| DMEM without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11054020 | |
| Fugene 6 | Promega | E2691 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| LabTek 8-well chambers #1.0 | Thermo Fisher Scientific | 12565470 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 |
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