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Comportamento

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Published: April 04, 2021
doi:
10.3791/62244
, , , ,
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics,The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics,University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Summary

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

Abstract

Caenorhabditis elegans는 다양한 인간 질병의 메커니즘과 치료를 효율적으로 심문하는 번역 동물 모델로서 중앙 유틸리티로 널리 인정받고 있습니다. 벌레는 빠른 개발 주기, 큰 무리 크기, 짧은 수명, 현미경 투명성, 낮은 유지 보수 비용, 게놈 도구의 강력한 제품군, 돌연변이 리포지토리 및 생체 내 생물학모두에서 중재하는 실험 방법론을 활용하여 치료 목표와 치료에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 높은 처리량 유전 및 약물 화면에 특히 적합합니다. 웜 운동 활동은 미토콘드리아 질환에서 자주 손상되는 특히 관련 표현형을 나타내며, 이는 원인과 증상에서 매우 이질적이지만 세포 에너지를 생산하는 장애인 용량을 집단적으로 공유합니다. 다른 방법론의 제품군은 웜 동작을 심문하는 데 사용될 수 있지만, 이들은 게놈 또는 약물 고처리량 스크린을 위한 실험 비용, 복잡성 및 유용성에 크게 변화합니다. 여기서, 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 상대적인 처리량, 장점 및 한계는 다른 단계, 나이 및 실험 기간에 있는 C. elegans의 단 하나 벌레 또는 벌레 집단에서 선충제 운동, 분쇄, 인두 펌핑 및/또는 화학요법을 정량화하는 비교되었습니다. 상세한 프로토콜은 사용 가능한 소프트웨어 도구, 즉 ZebraLab (중간 처리량 접근 법)과 WormScan (높은 처리량 접근 법)의 새로운 응용 프로그램을 나타내는 선충제 운동 활동을 정량화하는 두 가지 반자동 방법을 입증했습니다. 이러한 방법을 적용한 데이터는 L4 애벌레 단계에서 유사한 정도의 감소된 동물 활성을 입증하고, 1일째 성인에서 진행되었으며, 미토콘드리아 복합 I질환(gas-1(fc21)) 돌연변이 벌레는 야생형(N2 Bristol) C. elegans에비해 있었다. 이 데이터는 ZebraLab 또는 WormScan 소프트웨어 도구를 사용하여 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 거동에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 지원하는 가변 용량으로 웜 운동 활동을 효율적이고 객관적으로 정량화하는 이러한 새로운 응용 분야에 대한 유용성을 검증합니다.

Introduction

Caenorhabiditis elegans는 결합, 먹이 주기, 계란 누워, 배변, 수영 및 고체 매체1에서운동을 포함한 모든 웜 행동을 조정하는 302 개의 뉴런을 가진 신경 과학에서 뛰어난 모델로 널리 인정받고 있습니다. 이러한 헤마필로디컬 선충은 또한 C. elegans와 인간 사이의 ~80% 유전자의 잘 특징적인 게놈 및 높은 homology에 의해 가능하게 된 다양한 인간 질병 메커니즘을 이해하는 데 널리 사용된다2,3,4. C. elegans는 오랫동안 인간 미토콘드리아 질환5,6,7,8,9,10을심문하는 데 사용되어 왔으며, 이는 세포 에너지를 생성하기 위해 손상된 용량을 공유하는 유전적 및 변종성 대사 장애의 유전적 및 현상전형 이질적인 그룹이며, 종종 실질적으로 손상된 신경 근육 기능, 운동 편협 및 피로 111로 임상적으로 존재하는 것으로 나타났습니다. ,12,13,14. 이를 위해 C. elegans 모델을 사용하면 미토콘드리아 질환의 다른 유전 적 특수형에서 동물 활동 및 신경 근육 기능의 양적 측면과 신경 근육 기능의 전임상 모델링뿐만 아니라 신경 근육 기능 및 전반적인 활동을 향상시킬 수있는 후보 치료에 대한 반응을 가능하게합니다.

C. elegans의 신경 근육 활동은 고체 또는 액체 매체에서 기능 분석을 허용하는 수동 및 반자동 접근법을 모두 포함하는 다양한 실험 방법론에 의해 객관적으로 측정할 수있습니다(표 1)1,15. C. elegans 활동의 정확한 양은 근육 및 신경계 의 기능 및 발달과 관련된 발견을 가능하게 하는 것이 중요하다는 것을 입증하였다16,17,18. 이 연구는 C. elegans 질병 모델의 4가지 주요 결과에 대한 신경 근육 기능 및 활동을 평가하기 위해 연구 실험실에서 수행 될 수있는 17 가지 분석술의 실험 요구 사항, 장점 및 한계뿐만 아니라 후보 치료에 대한 응답으로 요약하고 비교합니다(표 1 ). 실제로, 이 연구는 C. elegans 스래싱(분당 몸 굽힘), 운동 활동, 인두 펌핑 및 화학 요법의 비율을 특성화하기 위해 사용 가능한 실험 적 접근법의 범위에 대한 상세한 개요를 제공하여 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 장비 및 소프트웨어를 수행하고 분석하는 데 필요한 각 사례에 제공합니다. 및 각 방법의 처리량 용량은 고처리량 유전 또는 약물 스크리닝 목적으로의 사용을 지원합니다. 각 분석법의 처리량 용량은 웜 유지 관리, 처리 시간, 단일 또는 다중 웰 플레이트의 사용 및/또는 실험자 시간을 포함하여 실험 프로토콜 복잡성에 기초하여 저, 중간 또는 높은 것으로 설명되며, 실험 설정 및 데이터 분석을 완료하는 데 필요한 실험시간.

스래싱19,운동활성(20,인두 펌핑17,21,및 화학요법22,23)의 수동 분석은 스테레오현미경(24)이필요한 웜 활성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법론이다. 벌레의 스래싱 활성을 측정하는 동안 분당 신체 굴곡의 주파수를 결정하기 위해 액체 매체에서 분석이 필요하지만, 웜 운동 활동은 고체 매체 또는 액체 매체에서 측정될 수 있습니다. 그러나 개별 웜 활동에 대한 수동 분석은 본질적으로 시간이 많이 소요되며 피할 수 없는 사용자 생성 편향이 수반됩니다. 웜 활동 분석의 자동화는 사용자 생성 편향을 최소화하고 실험처리량(25)을크게 증가시킬 수 있다. 액체 미디어에서 웜 스래싱 활동의 비디오 녹화는 wrMTrck, ImageJ 플러그인(26)을사용하여 분석 할 수 있습니다. 그러나 wrMTrck을 위해 개발된 원래 실험 설정은 단일 액체 낙하에 너무 많은 웜이 웜이 겹쳐정확한 추적을 어렵게 만들었기 때문에 유틸리티를 제한했습니다. 이러한 실험적 한계가27로해결되었지만 wrMTrck 방법은 고처리량 스크리닝을 지원할 수 없습니다.

C. elegans 미토콘드리아 질병 모델의 후보 치료에 대한 반응으로 기준선에서 웜 운동 활성을 정량화하는 다양한 방법이 존재한다. 여기에는 ZebraLab(뷰포인트 생명 과학), 티어셉시 트래커28,넓은 시야 선충 추적 플랫폼(WF-NTP)29,웜모텔, 웜워워서30,웜랩31,인피니티 칩32,WMicrotracker One33(표 1)이포함됩니다. 이러한 방법은 다중 웜 균주 또는 조건에서 운동을 동시 분석할 수 있게 해주며, 일반적으로 다중 웰 플레이트에서 더 높은 처리량 약물 스크리닝 응용 프로그램을 지원합니다. 이러한 방법 중 일부는 고가의 장비와 오픈 액세스 소프트웨어의 필요성, 실험 프로토콜 수행의 다양한 용이성 등 일반 유틸리티를 제한하거나 향상시킬 수 있는 고유한 고려 사항이 있습니다. 전반적으로 단일 실험 시스템이나 프로토콜이 모든 C. 예르간 운동 활동 실험에 이상적으로 적합하지 않습니다. 오히려 특정 조사자의 실험 목표와 요구 사항에 가장 적합한 방법을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.

인두 펌핑은 C. elegans에서신경 근육 활동을 평가하는 또 다른 중요한 결과를 나타냅니다. C. 엘레간인인은 20개의 근육 세포, 20개의 뉴런 및 20개의 다른 세포로 구성되어 있어 벌레의 성우34,35,36의전방 끝에 에슈리치아 대장균(E. coli)을섭취할 수 있다. 인두 펌핑 비율 17,21,37,38을결정하기 위한 몇 가지 수동 방법이 수립되었다. 대부분의 방법은 실험관찰자(21)에의해 직접 계수하여 인두 펌핑 주파수를 시각화하고 기록하는 스테레오현미경 및 카메라를 사용하는 것을 기반으로 한다. 자동화된 인두 펌핑 속도 분석은 각펌프(39)의지속 기간에 대한 추가 정보를 제공하는 세포외 기록인 전기파린지오그램(EPG)을 수행함으로써 가능하다. 개별 웜이 챔버40,41에국한되는 미세유체 시스템인 WormSpa에서도 인두 펌핑 속도 분석이 가능하다. 인두 펌프 속도의 분석을 용이하게 하는 상용 방법은 맞춤형 칩에 고정된 단일 웜에서 공급 동작의 신경 근육 측면을 측정, 시각화 및 분석하는 ScreenChip System(InVivo Biosystems)입니다. 이러한 인두 펌핑 수량 접근법은약물, 노화 및 기타요인42,43,44,45에대한 뉴런 및 생리적 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

화학요법은 선충 성장 매체(NGM) 플레이트의 정의된 영역에서 벌레로부터 떨어진 악취에 대응하여 C. 엘레건의 움직임을 설명합니다. 화학요법 반응을 평가하는 것은 정의된기간(46)에서벌레가 악취를 향해 이동하는 물리적 거리를 관찰하고 측정함으로써 정량화가능한 벌레 뉴런 및 신경근육 활성의 통합측정을 제공한다. 멀티 웜 트래커는 웜이 유인제 또는격퇴제(47)를향해 이동하는 거리를 정량화하는 실험 효율을 향상시키는 데 사용할 수 있는 자동 방법입니다.

여기서, 웜 활성을 정량화하기 위해 확립된 두 개의 새로운 반자동 방법에 대한 상세한 프로토콜이 설명된다. 첫 번째 접근법은 원래 다리오 리리오 (제브라피쉬)의 수영 활동을 연구하기 위해 개발 된 상용 소프트웨어를 활용하며, 움직임 중 픽셀 변화에 따라 C. elegans의 액체 매체에서 전체 운동 활동을 정량화하는 새로운 중간 처리량 응용 프로그램을 사용합니다(표 1, 그림 1). 이 방법은 다중 웰 플레이트 형식에 적합하지 않지만 데이터 출력은 유리 슬라이드에서 분석된 많은 수의 동시 조건 및 샘플에서 빠르게 가져옵니다. 두 번째 접근법은 Flatbed 스캐너를 사용하여 오픈 소스 소프트웨어와 함께 다양하게 사용할 수 있는 두 가지 순차 적 스캔의 차분이미지를 생성하여 fecundity 및 생존과 같은 통합 생리적 결과의 반자동 정량분석을 가능하게 하는 WormScan 방법론48,49 (그림 2)의새로운 적응입니다. 여기서, 96-well의 우물 당 15 개의 애벌레 단계 4 (L4) 벌레의 인구에서 액체 미디어에서 웜 운동 활성을 정량화하는 WormScan 방법론의 새로운 높은 처리량 적응이 개발되었다. 이 반자동 및 저비용 WormScan 방법론은 고처리량 약물 스크린뿐만 아니라 다양한 동물 단계와48세,49세의 분석에 쉽게 적응 할 수 있습니다.

여기서, ZebraLab과 WormScan 반자동 방법을 모두 사용하여 C. elegans locomotor 활성을 분석하는 프로토콜 및 효능은 미토콘드리아 복합 I 질환, 가스-1(fc21)에 대한 잘 확립된 C. elegans 모델에서 입증된다. 가스-1(K09A9.5 유전자)은 인간 NDUFS2(NADH: 유비퀴논 옥시도레덕타제 코어(철황 단백질) 서브유닛 2)의 직통술이다(도3). C. elegans gas-1(fc21)돌연변이 균주는 NDUFS250의인간 정형소로에서 균질 p.R290K 잘못된 감지 돌연변이를 운반하고, 현저히 감소된 대변과 수명, 손상된 호흡기 사슬 산화 인산화(OXPHOS) 용량51,및 소균성 및 8의 증가미토콘증및 수막을 통해 증가된 미토콘드(8) 증액 . 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 지난 2년간 잘 확립된 사용에도 불구하고 가스-1(fc21)돌연변이의 운동 활성은 이전에 보고되지 않았다. 여기서 ZebraLab 및 WormScan 방법은 야생형(WT, N2 Bristol) 웜과 비교하여가스-1(fc21)의운동 활성을 독립적으로 정량화하기 위해 적용되었으며, 둘 다 방법을 검증하고 실험 프로토콜 및 정보학 분석의 비교 유틸리티 및 효율성을 입증하는 방법으로서. ZebraLab 소프트웨어는 표적 약물 선별 또는 유효성 검사 연구를 위한 잠재적인 응용 프로그램과 함께 C. elegans 미토콘드리아 질병 모델에서 여러 동시 질환의 여러 동시 상태를 신속하게 허용했습니다. 특히 WormScan 분석은 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크린을 쉽게 활성화하고 1차 미토콘드리아 질환의 전임상 C. elegans 모델에서 동물 신경 근육 기능 및 운동 활동을 향상시키는 리드의 우선 순위를 정하는 데 적합합니다.

Protocol

1. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 유리 슬라이드에 액체 매체의 웜 운동 활동 분석 선충 성장 및 취급 선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 플레이트에 C. elegans를 성장하고 음식 소스로 Escherichia 대장균 OP50으로 확산. 이전에 설명된바와같이 20°C에서 웜 배양을 유지한다. 시간 제달 을 수행하는 벌레를 동기화52 원하는 단?…

Representative Results

액체 매체에서 C. elegans locomotor 활성의 분석은 고체 매체에서 쉽게 정량화되지 않을 수 있는 미토콘드리아 질병 웜 모델의 통합 표현형을 쉽게 포착할 수 있었다. ZebraLab은 L4 애벌레 단계에서 액체 매체에서 WTworms에 비해 잘 확립된 미토콘드리아 복합체 I 질환가스-1(fc21)의운동 활성을 정량화하는 데 사용되었습니다. 단일 액체 낙하에 5개의 벌레의 활성은 1분 이상 기록되었으?…

Discussion

여기에서, 연구 결과는 벌레 분쇄, 운동, 인두 펌핑 및 화학 요법을 포함하여 다양한 결과의 수준에서 C. elegans 신경 근육 활동을 공부하기 위한 상세한 정보 및 근거를 요약했습니다. 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 비교는 다른 연령 및 실험 기간에 단일 웜 또는 웜 집단에서 정량화선충 활동의 상대적 처리량, 장점 및 한계의 관점에서 수행되었다. 이 중, 반자동 분석의 두 가지 새로운 ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트의 초기 준비에 대한 조직적 지원과 프로토콜 분석에 기여한 에린 하우스(Erin Haus)에게 감사드립니다. 이 작품은 줄리엣의 치료 FBXL4 미토콘드리아 질병 연구 기금, Jaxson Flynt C12ORF65 연구 기금 및 국립 보건 원 (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863, 및 T2303-NS1307)에 의해 투자되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

Materials

C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).
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