Denna studie presenterar protokoll för två halvautomatiska lokomotoriska aktivitetsanalysmetoder i C. elegans komplexa I sjukdom gas-1(fc21)maskar, nämligen ZebraLab (en medium-throughput analys) och WormScan (en hög genomströmningsanalys) och ge jämförande analys bland ett brett utbud av forskningsmetoder för att kvantifiera nematod beteende och integrerad neuromuskulär funktion.
Caenorhabditis elegans är allmänt erkänd för sitt centrala verktyg som en translationell djurmodell för att effektivt förhöra mekanismer och terapier av olika mänskliga sjukdomar. Maskar är särskilt väl lämpade för genetiska och läkemedelsskärmar med hög genomströmning för att få djupare inblick i terapeutiska mål och terapier genom att utnyttja sin snabba utvecklingscykel, stora kullstorlek, korta livslängd, mikroskopisk transparens, låga underhållskostnader, robust svit av genomiska verktyg, mutanta databaser och experimentella metoder för att förhöra både in vivo- och ex vivo-fysiologi. Mask locomotor verksamhet representerar en särskilt relevant fenotyp som ofta försämras i mitokondriell sjukdom, som är mycket heterogen i orsaker och manifestationer men kollektivt delar en nedsatt kapacitet att producera cellulär energi. Medan en svit av olika metoder kan användas för att förhöra maskbeteende, varierar dessa kraftigt i experimentella kostnader, komplexitet och nytta för genomiska eller droghöggenomströmningsskärmar. Här jämfördes den relativa genomströmningen, fördelarna och begränsningarna för 16 olika aktivitetsanalysmetoder som kvantifierar nematodrörelse, thrashing, faryngala pumpning och/ eller kemotaxis i enstaka maskar eller maskpopulationer av C. elegans i olika stadier, åldrar och experimentella varaktigheter. Detaljerade protokoll demonstrerades för två halvautomatiska metoder för att kvantifiera nematod lokomotorisk aktivitet som representerar nya tillämpningar av tillgängliga programvaruverktyg, nämligen ZebraLab (en medelgenomströmningsmetod) och WormScan (en metod med hög genomströmning). Data från tillämpningen av dessa metoder visade liknande grader av minskad djuraktivitet inträffade i L4 larvstadiet och utvecklats i dag 1 vuxna, i mitokondriellt komplexa Isjukdom (gas-1(fc21)mutantmaskar i förhållande till vilda -typ (N2 Bristol) C. elegans. Dessa data validerar verktyget för dessa nya applikationer av att använda ZebraLab eller WormScan mjukvaruverktyg för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet effektivt och objektivt, med varierande kapacitet att stödja hög genomströmning drog screening på mask beteende i prekliniska djur modeller av mitokondriell sjukdom.
Caenorhabiditis elegans är allmänt erkänd som en enastående modell inom neurovetenskap baserat på att den har 302 nervceller som samordnar alla maskbeteenden, inklusive parning, utfodring, äggläggning, avföring, simning och rörelse på fasta medier1. Dessa hermafrodiska nematoder används också i stor utsträckning för att förstå ett brett spektrum av mänskliga sjukdomsmekanismer, som möjliggjordes av dess väl karakteriserade genom och höga homologi av ~ 80% gener mellan C. elegans och människor2,3,4. C. elegans har länge använts för att förhöra mänskliga mitokondriell sjukdom5,6,7,8,9,10, som är en mycket genetiskt och fenotypiskt heterogen grupp av ärftliga metabola störningar som delar nedsatt kapacitet att generera cellulär energi och ofta kliniskt närvarande med väsentligt nedsatt neuromuskulär funktion, träningsintolerans och trötthet11 ,12,13,14. I detta syfte möjliggör användningen av C. elegans-modeller preklinisk modellering av kvantitativa aspekter av djuraktivitet och neuromuskulär funktion i olika genetiska subtyper av mitokondriell sjukdom, liksom deras svar på kandidatterapier som kan förbättra deras neuromuskulära funktion och övergripande aktivitet.
Neuromuskulär aktivitet i C. elegans är objektivt mätbar med en rad experimentella metoder, inklusive både manuella och halvautomatiska metoder som möjliggör funktionella analyser i antingen fasta eller flytande medier(tabell 1)1,15. Korrekt kvantifiering av C. elegans aktivitet har visat sig viktigt för att möjliggöra upptäckter relaterade till funktion och utveckling av muskel- och nervsystemet16,17,18. Denna studie sammanfattar och jämför experimentella krav, fördelar och begränsningar av 17 olika analyser som kan utföras i forskningslaboratorier för att utvärdera neuromuskulär funktion och aktivitet på fyra viktiga resultat i C. elegans-sjukdomar modeller, både vid baslinjen i en rad utvecklingsstadier och åldrar samt som svar på kandidatterapier (Tabell 1 ). Studien ger en detaljerad översikt över utbudet av tillgängliga experimentella metoder för att karakterisera frekvensen av C. elegans thrashing (kroppsböjningar per minut), lokomotorisk aktivitet, faryngala pumpning och kemotaxis-i varje enskilt fall som anger den experimentella och analytiska metodik som används, fördelarna och begränsningarna för varje metod, den utrustning och programvara som behövs för att utföra och analysera varje analys, och genomströmningskapaciteten för varje metod för att stödja dess användning för genetiska screening- eller läkemedelsscreeningsändamål med hög genomströmning. Genomströmningskapaciteten för varje analys beskrivs som låg, medelhög eller hög baserat på experimentprotokollets komplexitet, inklusive maskunderhåll, bearbetningstid, användning av en- eller flerbrunnsplattor och/eller experimenterande tid som behövs för att slutföra den experimentella inställningen och dataanalyserna.
Manuella analyser av thrashing19,lokomotoriskaktivitet 20,faryngala pumpning17,21, och kemotaxis22,23 är väletablerade metoder för att utvärdera maskaktivitet som kräver ett stereomikroskop24. Vid mätning av maskarnas slagaktivitet krävs analys i flytande media för att bestämma frekvensen av kroppsböjningar per minut, men masklokomotorisk aktivitet kan mätas antingen på fast media eller i flytande media. Manuella analyser av individuell maskaktivitet är dock i sig tidskrävande och innebär oundviklig användargenererad partiskhet. Automatisering av maskaktivitetsanalyser minimerar användargenererad partiskhet och kan kraftigt öka experimentellt dataflöde25. Videoinspelningar av mask thrashing aktivitet i flytande media kan analyseras med wrMTrck, en ImageJ plugin26. De ursprungliga experimentella inställningarna som utvecklades för wrMTrck begränsade dock dess användbarhet, eftersom för många maskar i en enda vätskedroppe ledde till överlappning av maskar som gjorde noggrann spårning svår. Medan denna experimentella begränsning harlösts 27, kan wrMTrck-metoden inte stödja screening med hög genomströmning.
Det finns en rad metoder för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet vid baslinjen och som svar på kandidatbehandlingar i C. elegans mitokondriella sjukdomsmodeller. Dessa inkluderar ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,wide field-of-view nematodspårningsplattform (WF-NTP)29,WormMotel, WormWatcher30,WormLab31,Infinity Chip32och WMicrotracker One33 (Tabell 1). Dessa metoder möjliggör samtidig analys av rörelse i flera maskstammar eller förhållanden, vanligtvis på multi-well plattor, vilket stöder högre genomströmning drog screening applikationer. Vissa av dessa metoder har unika överväganden som kan begränsa eller förbättra deras allmänna nytta, till exempel behovet av dyr utrustning kontra programvara med öppen åtkomst och varierande enkel att utföra experimentella protokoll. Sammantaget är inget enda experimentellt system eller protokoll idealiskt lämpat för alla C. elegans lokomotoriska aktivitetsexperiment. Det är snarare viktigt att noggrant välja vilken metod som är bäst lämpad för den specifika prövarens experimentella mål och krav.
Faryngala pumpning representerar ett annat viktigt resultat för att bedöma neuromuskulär aktivitet i C. elegans. C. elegans pharynx består av 20 muskelceller, 20 nervceller och 20 andra celler som möjliggör intag av Escherichia coli (E. coli) i den främre änden av maskens matsmältningsorgan34,35,36. Flera manuella metoder har fastställts för att bestämma faryngala pumphastigheter17,21,37,38. De flesta metoder är baserade på användningen av ett stereomikroskop och kamera för att visualisera och registrera faryngala pumpfrekvens med direkträkning av den experimentella observatören21. Automatiserad analys av faryngala pumphastigheter är möjlig genom att utföra ett extracellulärt registreringsbelagt elektrofarmageogram (EPG), som ger ytterligare information om varaktigheten för varje pump39. Faryngala pumphastighet analys är också möjligt i ett mikrofluidiskt system, WormSpa, där enskilda maskar är instängda ikamrarna 40,41. En kommersiell metod som finns tillgänglig för att underlätta analys av faryngala pumphastigheten är ScreenChip System (InVivo Biosystems), som mäter, visualiserar och analyserar de neuromuskulära aspekterna av utfodringsbeteende i en enda mask som immobiliseras i ett anpassat chip. Denna faryngala pumpande kvantifieringsmetod kan användas för att bedöma både neuronala och fysiologiska svar på droger, åldrande och andrafaktorer 42,43,44,45.
Chemotaxis beskriver rörelsen av C. elegans som svar på en lukt som placeras bort från maskarna i ett definierat område av nematod tillväxt media (NGM) plattan. Bedömning av kemotaxis svar ger ett integrerat mått på mask neuronal och neuromuskulär aktivitet som är kvantifierbar genom att observera och mäta den fysiska sträckan som rör sig av maskar mot lukten under en definierad tidsperiod46. Multi-Worm Tracker är en automatisk metod som kan användas för att förbättra den experimentella effektiviteten att kvantifiera avståndet som rör sig av maskar mot ett lockande medel eller från en avstötande47.
Här beskrivs det detaljerade protokollet för två nya, halvautomatiska metoder som fastställts för kvantifiering av maskaktivitet. Det första tillvägagångssättet använder ZebraLab en kommersiell programvara som ursprungligen utvecklades för att studera simaktivitet hos Danio rerio (zebrafisk), för en ny medelgenomströmningsapplikation för att kvantifiera övergripande lokomotorisk aktivitet i flytande media av C. elegans baserat på pixelförändringar under rörelse ( Tabell1, figur 1). Datautgång erhålls snabbt från ett stort antal samtidiga förhållanden och prover som analyseras på en glasbild, även om denna metod inte är lämplig för ett multi-well-plattformat. Det andra tillvägagångssättet är en ny anpassning av WormScan-metoden48,49 ( Figur2), som använder en flatbäddsskanner för att skapa en differentialbild av två sekventiella skanningar som variabilt kan användas med programvara med öppen källkod för att möjliggöra halvautomatisk kvantitativ analys av integrerade fysiologiska resultat som fecundity och överlevnad. Här utvecklades en ny filmatisering av WormScan-metoden för att kvantifiera mask lokomotorisk aktivitet i flytande media i populationer av femton larvsteg 4 (L4) maskar per brunn av en 96-brunns platt bottenplatta. Denna halvautomatiska och billiga WormScan-metodik kan enkelt anpassas till höggenomströmningsdrogskärmar, liksom till analyser av olika djurstadier ochåldrar 48,49.
Här demonstreras protokollet och effekten av att analysera C. elegans lokomotorisk aktivitet med både ZebraLab och WormScan halvautomatiska metoder i en väletablerad C. elegans modell för mitokondriell komplex I sjukdom, gas-1(fc21). gas-1 (genen K09A9.5) är en ortolog av human NDUFS2 (NADH: ubiquinone oxidoreductase core (järn-svavelprotein) underavdelning 2) (Figur 3). C. elegans gas-1(fc21) mutant stam bär en homozygous p.R290K missense mutation i den mänskliga orthologen av NDUFS250, orsakar betydligt minskad fecundity och livslängd, nedsatt andningskedja oxidativ fosforylering (OXPHOS)kapacitet 51, samt minskad mitokondriell massa och membran potential med ökad oxidativ stress5,8 . Trots dess väletablerade användning under de senaste två decennierna för att studera mitokondriell sjukdom, rapporterades inte lokomotorisk aktivitet av gas-1(fc21)mutanter tidigare. Här tillämpades ZebraLab- och WormScan-metoder för att självständigt kvantifiera den lokomotoriska aktiviteten hos gas-1(fc21) jämfört med vilda maskar (WT, N2 Bristol), både som ett sätt att validera metoderna samt för att visa deras jämförande nytta och effektivitet hos experimentella protokoll och informatikanalyser. ZebraLab programvara tillät snabb kvantifiering av flera samtidiga villkor för mask locomotor verksamhet i C. elegans mitokondriell sjukdom modeller, med potentiell tillämpning för riktade drog screening eller validering studier. WormScan analys, i synnerhet, är väl lämpad för att lätt möjliggöra hög genomströmning drog skärmar av sammansatta bibliotek och prioritera leads som förbättrar djuret neuromuskulär funktion och den lokomotoriska aktiviteten i prekliniska C. elegans modeller av primära mitokondriell sjukdom.
Här sammanfattade studien detaljerad information och motiveringar för att studera C. elegans neuromuskulär aktivitet på nivån för olika resultat, inklusive mask thrashing, rörelse, faryngala pumpning och chemotaxis. Jämförelsen av 16 olika aktivitet analys metoder utfördes när det gäller relativa genomströmning, fördelar och begränsningar av kvantifiera nematod verksamhet i en enda mask eller mask populationer i olika åldrar och experimentella varaktigheter. Bland dessa lyftes två nya anpassning…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Anthony Rosner, phD., med hans organisatoriska stöd för den tidiga förberedelsen av detta projekt, och till Erin Haus för att bidra till protokollanalys. Detta arbete finansierades av Juliets Cure FBXL4 Mitokondriell sjukdomsforskningsfond, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund och National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 och T32-NS007413). Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärerna eller De nationella hälsoinstitutens officiella åsikter.
C. elegans wild isolate | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
Camera | Olympus | DP73 | |
gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
Microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS | |
Nematode Growth Medium (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
OP50 Escherichia coli | CGC | Uracil auxotroph E. coli strain | |
Petri dishes (60 mm) | VWR international | 25373-085 | |
S. Basal | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O | VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
Scanner | EPSON | V800 | |
Stereomicroscope | Olympus | MVX10 microscope | |
96-well flat bottom | VWR international | 29442-056 | |
WormScan software | Mathew et al. 45 | S1 Standalone Java platform | Software for automation of difference image of scanned plates |
ZebraLab software | ViewPoint | Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis |