물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.
단분산 된 물방울에서 수행 된 반응은 대량으로 수행 되는 동등한 것과 비교하여 향상된 정확도와 감도를 부여합니다. 그러나, 제어 된 물방울을 형성 하기 위해 미세 유체의 요구 는 비 전문가에 장벽을 부과, 그들의 사용을 제한. 여기서는 미세유체가 없는 단분산 방울을 생성하는 접근법인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다. 감광 하이드로겔 구체를 사용하여 간단한 소용돌이로 단분산 된 물방울에 샘플을 캡슐화합니다. 우리는 미세 유체없는 디지털 PCR을 수행하기 위해 그것을 사용하여 접근 방식을 보여줍니다.
방울 미세 유체액은 피콜리터 액적물의 구획화를 활용하여 대량 반응에 비해 분석의 감도와 정확도를 높이고 화학 스크리닝, 단백질 공학 및 차세대 시퀀싱1,2,3에 많은 응용 을 적용합니다. 예를 들어, 디지털 물방울 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR)은 암의 유전적 변이, 돌연변이를 유발하는 질병의 검출, 산전 진단4,5,6에 비해 정밀도가 높아집니다. 그러나 액적 미세 유체학의 과제는 미세 유체 장치가 샘플을 분할하는 데 요구되는 것입니다. 미세 유체는 방울 특성을 잘 제어 할 수 있지만, 그들은 구축하고 운영하기 위해 전문 지식이 필요합니다7,8. 따라서 물방울 기반 방법은 주로 전문 실험실또는 상용 기기를 사용할 수 있는 응용 프로그램으로 제한됩니다9,10. 물방울 분석의 사용을 확대하기 위해, 특수 미세 유체 계측에 대한 요구 사항은 극복해야 장애물이다.
이 문서에서는 단일 분산 된 물방울에서 반응을 수행하기위한 미세 유체없는 방법인 입자 템플릿 유화제 (PTE)를 설명합니다. PTE에서, 템플릿 입자는 간단한 소용돌이에 의해 캐리어 오일의 물방울에 샘플을 삼켜 (그림 1). 시스템이 혼합되면, 수성 부는 액적이 단일 입자를 포함할 때까지 크기를 줄이는 방울로 조각되며, 이 때 입자를 파괴해야 하기 때문에 추가 조각화가 불가능합니다. 침몰한 시료는 입자를 물방울의 쉘로 둘러싸고 분산된 세포, 시약 또는 기능적 모이티(그림 1D)를 캡슐화합니다. 따라서 PTE는 일반적인 소용돌이 를 넘어 액적 반응을 수행하기 위한 장비 나 전문 지식이 필요하지 않습니다. 또한, 액적 생성은 미세 유체와 분 또는 시간에 비해 몇 초 가 걸리며, 생산된 양은 장치 작동 시간이 아닌 컨테이너 부피에 비례하여 확장성이 매우 가능합니다. 이러한 이점은 PTE가 미세 유체제가 비실용적이는 다양한 상황에서 물방울 검사를 수행하는 데 이상적입니다. 여기에서 PTE를 시연하고 ddPCR을 수행하는 데 사용합니다.
그림 1. 파티클 템플릿 유화제 프로세스의 개요입니다. (A) 측동기 입자는 시약과 혼합된다. (B) 원심 분리 후 초과 시약이 제거됩니다. (C) 템플릿 분자의 첨가는 오일을 첨가하기 전에 발생합니다. (D) 소용돌이는 단일 템플릿 분자를 포함하는 방울을 생성합니다. (E) 후속 열순환 및 이미징을 통해 대상 템플릿의 디지털 물방울 분석을 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PTE는 입자를 사용하여 소용돌이를 통해 단분산 된 물방울에 샘플을 캡슐화합니다. PTE는 단순성과 접근성 외에도 대량의 액적을 즉시 생성할 수 있도록 하는 등 몇 가지 추가 이점을 제공합니다. 더욱이, 이 과정은 격리된 튜브에서 수행될 수 있으며, 샘플을 미세 유체 장치로 이송할 필요성을 없애고, 전체 워크플로우를 간소화하고, 시료 오염 또는 손실에 대한 기회를 제한할 수 있다. 또한 템플릿 입자는 결과 액적 반응의 내용을 엔지니어링하는 수단을 제공합니다. 예를 들어, 입자 크기, 화학 및 웨트성은 표적 생체 분자 또는 세포 포획을 위해 설계될 수 있으며, 효소, 활성 또는 핵산과 같은 기능적 모니티는 단일 세포 염기서열 분석 또는 기능적 특성화와 같은 반응을 용이하게 하기 위해 입자에 표시될 수 있다. 접근 방식은 유연하지만 사용에 중요한 제약 조건이 있습니다. 예를 들어, 미세 유체로 자주 수행되는 것처럼 현재 액적 추가를 수행할 수 없으며, 캡슐화 전에 모든 반응 성분을 도입해야 합니다. 이를 위해서는 물방울이 생성될 때까지 시약이 호환되고 안정적이어야 하며, 번거로운 조합의 경우 얼음 시료를 신속하게 혼합하고 유화하여 해결할 수 있습니다. 또는 빛이나 열로 외부에서 트리거할 수 있는 반응성 성분을 사용할 수 있습니다13. 따라서 PTE는 전문가가 액세스할 수 있는 액적 분해를 수행하기 위한 유연하고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 이는 타고난 단순성과 유연성과 결합되어 PTE가 수많은 물방울 응용 프로그램의 실행 및 개발에 이상적입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로토콜을 개발하는이 작업은 국립 보건원 (R01-EB019453-02)에 의해 지원되었다, 국가 정보 국장의 사무실, 레이시온 BBN 테크놀로지스(N66001-18-C-4507), 찬주커버그 바이오허브 조사프로그램, 텍사스 A&M 대학(W911NF1920013) 및 존스홉킨스대학을 통한 질병통제예방센터(D911NF1920013) 및 질병통제예방센터(D66001-18-C-4507)를 통한 지능형 연구 프로젝트 활동 물리 연구소 (75D30-11-9C-06818 (CDC3). 여기에 포함된 견해와 결론은 저자의 견해이며, 반드시 상기 조직이나 미국 정부의 공식 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 미국 정부는 저작권 에 대한 저작권 의에도 불구하고 정부 목적을 위해 재인쇄물을 복제하고 배포할 권한이 있습니다.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |