نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الوريد الخلفي لخلايا سرطان الثدي الالتهابية
Summary
نحن نصف نموذج فأر xenograft لورم خبيث في الدماغ لسرطان الثدي الناتج عن حقن الوريد الخلفي لخط خلايا سرطان الثدي الالتهابي المضخم HER2 داخليا.
Abstract
الانتشار النقيلي إلى الدماغ هو مظهر شائع ومدمر للعديد من أنواع السرطان. في الولايات المتحدة وحدها ، يتم تشخيص حوالي 200000 مريض بنقائل الدماغ كل عام. تم إحراز تقدم كبير في تحسين نتائج البقاء على قيد الحياة للمرضى الذين يعانون من سرطان الثدي الأولي والأورام الخبيثة الجهازية. ومع ذلك ، فإن التشخيص الكئيب للمرضى الذين يعانون من النقائل الدماغية السريرية يسلط الضوء على الحاجة الملحة لتطوير عوامل واستراتيجيات علاجية جديدة ضد هذا المرض الفتاك. كان عدم وجود نماذج تجريبية مناسبة أحد العقبات الرئيسية التي تعوق تقدم فهمنا لبيولوجيا ورم خبيث في الدماغ وعلاجه. هنا ، نصف نموذج فأر xenograft لورم خبيث في الدماغ تم إنشاؤه عن طريق حقن الوريد الخلفي لخط خلية مضخم داخليا HER2 مشتق من سرطان الثدي الالتهابي (IBC) ، وهو شكل نادر وعدواني من سرطان الثدي. تم تصنيف الخلايا باستخدام لوسيفيراز اليراع وبروتين مضان أخضر لمراقبة ورم خبيث في الدماغ ، وتقدير العبء النقيلي عن طريق التصوير الحيوي ، والمجهر المجسم الفلوري ، والتقييم النسيجي. تطور الفئران بقوة وثبات نقائل الدماغ ، مما يسمح بالتحقيق في الوسطاء الرئيسيين في العملية النقيلية وتطوير الاختبارات قبل السريرية لاستراتيجيات العلاج الجديدة.
Introduction
ورم خبيث في الدماغ هو أحد المضاعفات الشائعة والمميتة للأورام الخبيثة الجهازية. تنشأ معظم نقائل الدماغ من الأورام الأولية في الرئة أو الثدي أو الجلد ، والتي تمثل مجتمعة 67-80٪ من الحالات 1,2. تتراوح تقديرات حدوث ورم خبيث في الدماغ بين 100,000 إلى 240,000 حالة ، وقد تكون هذه الأرقام أقل من الواقع لأن تشريح الجثة نادر الحدوث للمرضى الذين ماتوا بسبب السرطان النقيلي3. المرضى الذين يعانون من النقائل الدماغية لديهم تشخيص أسوأ وانخفاض البقاء على قيد الحياة بشكل عام بالنسبة للمرضى الذين لا يعانون من النقائل الدماغية4. خيارات العلاج الحالية لنقائل الدماغ ملطفة إلى حد كبير وتفشل في تحسين نتائج البقاء على قيد الحياة لمعظم المرضى5. وبالتالي ، لا يزال ورم خبيث في الدماغ يمثل تحديا ، ولا تزال الحاجة ملحة لفهم آليات تطور ورم خبيث في الدماغ بشكل أفضل لتطوير علاجات أكثر فعالية.
قدم استخدام النماذج التجريبية رؤى مهمة حول آليات محددة لتطور سرطان الثدي النقيلي إلى الدماغ وسمح بتقييم فعالية الأساليب العلاجية المختلفة6،7،8،9،10،11،12،13،14،15،16. ومع ذلك ، يمكن لعدد قليل جدا من النماذج تلخيص تعقيدات تطور ورم خبيث في الدماغ بدقة وبشكل كامل. تم إنشاء العديد من النماذج التجريبية في الجسم الحي عن طريق تلقيح الخلايا السرطانية في الفئران بطرق مختلفة للإعطاء ، بما في ذلك تقويم العظام ، والوريد الذيلي ، داخل القلب ، والشرايين السباتية ، والحقن داخل المخ. كل تقنية لها مزايا وعيوب ، كما تمت مراجعته في مكان آخر3. ومع ذلك ، لا يمكن لأي من نماذج الفئران هذه تكرار التقدم السريري لورم خبيث في الدماغ بشكل كامل.
النقائل الدماغية شائعة بشكل خاص في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي الالتهابي (IBC) ، وهو نوع نادر ولكنه عدواني من سرطان الثدي الأولي. تمثل IBC 1٪ إلى 4٪ من حالات سرطان الثدي ، لكنها مسؤولة عن 10٪ غير متناسبة من الوفيات المرتبطة بسرطان الثدي في الولايات المتحدة17,18. من المعروف أن IBC ينتشر بسرعة. في الواقع ، يعاني ثلث مرضى IBC من ورم خبيث بعيد في وقت التشخيص19,20. خاصة بورم خبيث في الدماغ ، فإن المرضى الذين يعانون من IBC لديهم نسبة أعلى من ورم خبيث في الدماغ مقارنة بالمرضى الذين يعانون من غير IBC21. في الآونة الأخيرة ، أثبتنا أن خط خلايا MDA-IBC3 ، المشتق من سائل الانصباب الجنبي الخبيث لمريض مصاب ب ER / PR – / HER2 + IBC الذي يلخص خصائص IBC في الطعوم الخارجية للفئران ، لديه ميل محسن لتطوير نقائل الدماغ بدلا من نقائل الرئة في الفئران عند حقنها عن طريق الوريد الذيل ، مما يجعل خط الخلية هذا نموذجا جيدا لدراسة تطور ورم خبيث في الدماغ16.
هنا نصف إجراءات توليد ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الوريد الخلفي لخلايا MDA-IBC3 وتقييم العبء النقيلي عن طريق الفحص المجهري الفلوري المجسم وتصوير لوسيفيراز. تم استخدام هذه الطريقة لاكتشاف الوسطاء الرئيسيين لورم خبيث لسرطان الثدي إلى الدماغ واختبار فعالية التدخلات العلاجية16،22،23. عيب هذه التقنية هو أنها لا تلخص جميع الخطوات في عملية النقيلي في الدماغ. ومع ذلك ، فإن مزاياه الرئيسية تشمل المتانة والتكاثر ، وإشراك بيولوجيا ورم خبيث ذات صلة من intravasation ، وعبور الرئتين وتسرب إلى الدماغ ، وبساطته النسبية من حيث التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتضمن البروتوكول عدة خطوات حاسمة. يجب أن تبقى الخلايا على الجليد لمدة لا تزيد عن 1 ساعة للحفاظ على البقاء. يجب استخدام ضمادات قطنية كحولية لمسح ذيول الفئران قبل الحقن ، مع الحرص على عدم المسح بشدة أو في كثير من الأحيان لتجنب إتلاف جلد الذيل. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في تعليق الخلية ، لمنع…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كريستين إف ووغان ، MS ، ELS ، من قسم MD Anderson لعلم الأورام الإشعاعي على التحرير العلمي للمخطوطة ، وكارول إم جونستون من قسم الأنسجة الجراحية في MD Anderson للمساعدة في تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. نحن ممتنون لمركز الطب البيطري والجراحة في MD Anderson لدعمهم للدراسات على الحيوانات. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: منحة Susan G. Komen Career Catalyst Research (CCR16377813 إلى BGD) ، ومنحة باحث أبحاث جمعية السرطان الأمريكية (RSG-19-126-01 إلى BGD) ، وبرنامج أبحاث سرطان الثدي النادر والعدواني في ولاية تكساس. مدعوم أيضا جزئيا من قبل دعم مركز السرطان (Core) Grant P30 CA016672 من المعهد الوطني للسرطان ، المعاهد الوطنية للصحة ، إلى مركز إم دي أندرسون للسرطان بجامعة تكساس.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
Riferimenti
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Ricerca sul cancro. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Ricerca sul cancro. 80 (4), 10 (2020).
