I denne protokollen beskrives en in vitro culturing og funksjonell analysemetode for muskelstammeceller, som bevarer det meste av deres interaksjoner med deres endogene nisje.
Voksen skjelettmuskulaturvev har en stamcellepopulasjon som er uunnværlig for sin evne til å regenerere. Ved muskelskader forlater muskelstammeceller sin passiv tilstand og aktiverer det myogene programmet som til slutt fører til reparasjon av skadet vev samtidig med etterfylling av muskelstammecellebassenget. Ulike faktorer påvirker muskel stamcelle aktivitet, blant dem iboende stimuli, men også signaler fra direkte muskel stamcelle miljø, stamcelle nisje. Isolasjonen og kulturen til enslige myofibers med deres tilknyttede muskelstammeceller bevarer det meste av samspillet mellom stamcellen med sin nisje og er derfor den nærmeste muligheten til å studere muskel stamcellefunksjonalitet ex vivo. Her er en protokoll for isolasjon, kultur, siRNA transfeksjon og immunstaining av muskel stamceller på sine respektive myofibers fra mus EDL (extensor digitorum longus) muskler gitt. De eksperimentelle forholdene som er skissert her tillater studie og manipulering av muskel stamceller ex vivo inkludert undersøkelse av myogen aktivitet uten det iboende behovet for in vivo dyreforsøk.
Skjelettmuskulatur i voksen er et postmitotisk vev som hovedsakelig består av multinukleerte myofibers, som er effektorcellene for frivillige bevegelser. Den har en bemerkelsesverdig evne til å regenerere, en prosess som ligner embryonal myogenese og gjennomgår svekkelser i alder og sykdom1. Denne slående regenerative kapasiteten til skjelettmuskulaturen avhenger av muskelstammeceller (MuSCer), som også kalles satellittceller på grunn av deres plassering mellom sarcolemma og basal lamina av myofibers2,3. Under hvileforhold er MuSC-er passiviserte og preget av uttrykket av transkripsjonsfaktoren Pax7 og passiviseringsmarkører som Sprouty14,5,6,7,8. Ved aktivering, for eksempel etter skade, forlater MuSCs passiv tilstand og oppregulerer den myogene regulatoriske faktoren MyoD9. Pax7 /MyoD dobbeltpositive MuSC-er sprer seg og differensierer dermed myogene forløperceller, som også ofte kalles myoblaster. Disse myoblastene skiller seg deretter ytterligere ut i langstrakte myocytter, en prosess som sammenfaller med molekylære og morfologiske endringer, for eksempel tap av Pax7 og oppregulering av Myogenin-uttrykk10. Myocytter smelter deretter til slutt sammen eller til eksisterende myofibers og reparerer dermed det skadede vevet. Viktigst, en liten brøkdel av muskel stamceller tilbakestiller MyoD upregulering og er i stand til selvfornyelse11. Statusen til MuSC differensiering og myogen progresjon kan lett observeres ved undersøkelse av myogene markører som Pax7, MyoD og Myogenin10.
Kulturen til single myofibers med sine tilstøtende MuSCs er en utmerket metode for å undersøke MuSC-funksjonalitet i en ex vivo-setting siden MuSCs forblir i sin endogene nisje12,13. Oppførselen til MuSCs er regulert av iboende signaler samt ekstrinsiske signaler levert av nisjen, et spesialisert anatomisk sted som består av komponenter i den ekstracellulære matrisen (ECM) rundt MuSCene og myofiberen selv. For eksempel er en av de ekstrinsiske regulatorene til MuSC-passiviteten Notch-signalering. Her mottas signalsignaler av MuSCer fra både myofiber og ECM14,15,16. Videre er MuSC-nisjen viktig for å kontrollere divisjonsaksen til MuSCer og dermed regulere celle skjebnen til MuSC datterceller17,18. Rimelig, parametere som asymmetriske MuSC-divisjoner, myogen progresjon og selvfornyelse kan vurderes unikt i dette eksperimentelle oppsettet. For eksempel kan en multicellulær klynge dannes som følge av en MuSC etter en kulturperiode på 72 timer, som kan undersøkes for forekomsten og prosentandelen av distinkte myogene populasjoner som selvfornyelse, spredning og ytterligere differensierte MuSCer8,19,20,21. Differensieringstilstanden til MuSC-er kan bestemmes ved undersøkelse av uttrykket / meduttrykket til Pax7, MyoD og Myogenin. Etter 72 timers kultur kan cellene i en klynge diskrimineres av følgende parametere: Pax7 bare celler er selvfornyende MuSCer, mens Pax7 / MyoD doble positive celler sprer / aktiverte MuSCer og ytterligere differensierte myogene celler er Myogenin positive22. Videre kan MuSC-tall eller gjeninnføring i cellesyklusen/aktiveringen undersøkes i tillegg til myogen progresjon, for eksempel gjennom immunfluorescensbaserte analyser basert på parametrene beskrevet ovenfor.
Her beskrives de unike egenskapene til myofiberisolasjons- og kulturprotokollen, for eksempel bevaringen av samspillet mellom MuSC og dens nisje. Mus hele EDL (extensor digitorum longus) muskler er nøye dissekert, fordøyd av kollagenose, og fysisk triturert for å oppnå enkelt myofibers med sine tilknyttede MuSCs for videre kultur. Videre avgrenser protokollen trinnene for å transfekte muSC-er med siRNA for funksjonelle analyser av kandidatgener og påfølgende immunfluorescensbaserte analyser uten nødvendigheten av transgene dyr.
Her presenteres en metode for å undersøke rollen til et bestemt gen i MuSCer ved hjelp av en in vitro-tilnærming. Viktigst, i systemet som er beskrevet her, er muSCene dyrket under forhold, som ligner in vivo-situasjonen så mye som mulig og bevarer de fleste interaksjonene til muscene med deres nisje. Dette oppnås ved å dyrke isolerte myofibers med sine tilstøtende muSC-er under flytende forhold og påfølgende siRNA-transfeksjon. Prosedyrene for myofiberisolasjon, siRNA-transfeksjon og undersøkelse av MuSC-populasjoner i løpet av 72 timers kultur gjennom immunfluorescensanalyser beskrives. Videre ble det demonstrert at rundt 74% av alle muSC-er ble transfektert med en fluorescerende merket kontroll siRNA etter 30 timers kultur.
Spesiell oppmerksomhet bør fokuseres på forsiktig disseksjon av EDL muskelen siden omfattende strekk, klemming eller klemming vil føre til sammentrekning og påfølgende død av myofibers. Videre er det viktig å undersøke klynger av muSC-er fra minst 20 forskjellige myofibers per replikering per tilstand. Dette er nødvendig siden MuSC-tall og egenskaper varierer på grunn av eksistensen av MuSC-subpopulasjoner. Når du undersøker effekten av en bestemt siRNA på MuSCs ved hjelp av flytende myofiber kulturmetode, bør en sammenligning av tilstanden med målretting siRNA til ikke-målretting kontroll utføres innenfor samme mus og muskel. Dette anbefales for å unngå musespesifikke forskjeller som kan dekke eller forsterke effekten av siRNA. Nedslagseffektiviteten kan bestemmes av immunfluorescensanalyser med antistoffer rettet mot målgenet ved hjelp av enkelt myofibers med deres tilstøtende MuSCer. Hvis dette ikke er et alternativ, kan man teste siRNA knockdown-effektiviteten i primære myoblaster etterfulgt av kvantitative RT-PCR- eller immunoblotanalyser. Effektiviteten til siRNA bør bestemmes før du analyserer effekten av siRNA på muSCer på enkelt myofibers. Bruken av et smart basseng som består av 4 forskjellige siRNAer kontra en enkelt, øker knockdown-effektiviteten, men øker også risikoen for uspesifisert målretting. En siRNA som ikke er målrettet, bør brukes som en kontroll. For å overvåke transfeksjonseffektiviteten direkte, kan man bruke en fluorescerende merket ikke-målrettende siRNA som utført her. Tidspunktet for transfeksjon med siRNA er rundt 4 timer etter isolasjon, et tidspunkt da basal lamina rundt muSCene allerede er gjennomtrengelig for siRNA. Hvis effekten av en bestemt siRNA på MuSCs etter 72 eller 96 h skal undersøkes, anbefales det å utføre en annen siRNA-transfeksjon etter 24 timer eller 48 timer for å opprettholde en høy knockdown-effektivitet.
Myofiberkulturanalysen viser forskjellige fordeler sammenlignet med undersøkelsen av MuSC-er med konvensjonelle cellekulturmetoder. MuSCer forblir festet til myofibers under hele isolasjonsprosessen, og bevarer dermed det avgjørende samspillet mellom MuSC med sin nisje19,23,24,25. Den bevarte interaksjonen mellom MuSC-er med myofiberen er en forutsetning for å studere nisjeavhengige effekter på MuSC-funksjonalitet, som ikke kan rekapituleres i konvensjonelle 2D-myoblastkulturer. For eksempel, under aldring MuSCs skjerm svekket myogen kapasitet resulterer i redusert effektivitet for å regenerere muskelvev etter skade20,26. Denne svekkelsen skyldes i det minste delvis endringer i MuSC-nisjen, spesielt endringer i ECM-sammensetningen27,28. Myofiberkulturprotokollen tillater studie og forstyrrelser med disse avvikende nisjeendringene.
I motsetning til metoden som er beskrevet her, innebærer rensing av MuSC-er ved immunisolering og sorteringsteknikker som FACS (fluorescensaktivert cellesortering) eller MACS (magnetisk cellesortering) fjerning av MuSC-ene fra deres nisje. Interessant nok mister 2D-kulturer av isolerte muSC-er fra aldrende muskler sine ekstrinsiske signaler og oppfører seg som MuSCs isolert fra unge muskler og dermed ikke recapitulaterer in vivo-situasjonen riktig29. Videre resulterer fullstendig dissosiasjon av muskelvev og merking av MuSCer med overflatemarkører i transkripsjonsendringer og aktivering av cellene30,31,32. En annen fordel med myofiberkultursystemet er muligheten til å forstyrre MuSC-funksjonaliteten på ulike nivåer. Manipulering av MuSC-er på dyrkede myofibere kan effektivt oppnås ved siRNA-mediert gen-knockdown som beskrevet her i detalj. På samme måte er anvendelsen av kjemiske forbindelser eller levering av rekombinante proteiner svært effektiv for å forstyrre stamcellebanene20,28. Videre tillater retro- eller lentivirale uttrykksvektorer innføring av eksogene gener, det vil si konstitutive aktive mutanter33. I tillegg kan påvirkningen av ekstrinsiske faktorer på MuSC-funksjonalitet utforskes i systemet som er beskrevet her, for eksempel kan kulturforholdene suppleres med supernatant fra forskjellige fysiologiske eller patologiske kilder for å modellere forskjellige tilstander som kreftbufferxia34,35.
En begrensning av metoden som er beskrevet her er det faktum at det enkle myofiberkultursystemet ikke helt kan rekapitulere virkningen av alle systemiske faktorer eller påvirkning av andre celletyper på MuSCer. Også tiden da myofibers kan holdes levedyktig i kulturen er begrenset, og derfor fokuserer studiet av MuSC-relaterte prosesser på tidlige hendelser som aktivering og myogent engasjement. Videre er undersøkelsen av MuSC-interaksjonen med andre nisjeceller som immunceller eller fibro-adipogene stamceller ikke mulig. For å undersøke systemiske effekter på MuSC-funksjonalitet kan man enten utføre muskelskadeforsøk etterfulgt av analyse av muskelregenerering in vivo eller utføre transplantasjonsforsøk36,37.
Samlet gir myofiberisolasjons- og kulturprotokollen gode muligheter for genetiske eller mekanistiske studier på voksne muSC-er uten krav om transgene musemodeller og kan potensielt redusere dyreforsøk.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christine Poser og Christina Picker for utmerket teknisk assistanse og kritisk lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til JvM (MA-3975/2-1), Carl Zeiss foundation og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005).
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG 2b | ThermoScientific | A-21141 | use 1:1000 for IF |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | ThermoScientific | A-21123 | use 1:1000 for IF |
chicken embryo extract | Seralab | CE-650-J | chicken embryo extract containing growth factors etc. |
collagenase type 1 | Sigma | C0130 | |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5 g/l glucose and sodium pyruvate) | GibCo | 41966029 | cell culture medium |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | fetal bovine serum |
horse serum | Gibco | 26050-088 | |
Lipofectamine RNAiMax | ThermoScientific | 13778150 | transfection reagent |
MyoD antibody clone G-1 | Santa Cruz | sc-377460 | dilute 1:200 for IF |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | use undiluted |
siGLO Red Transfection Indicator | horizon discovery | D-001630-02-05 | non targeting siRNA |