NMR에 의한 단편 기반 스크리닝은 생체고분자(DNA, RNA 또는 단백질)에 대한 소분자 결합제를 신속하게 식별하는 강력한 방법입니다. 자동화 기반 시료 전처리, NMR 실험 및 획득 조건, 분석 워크플로우를 설명하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술은 검출을 위해 1H 및 19FNMR 활성 핵 모두를 최적으로 이용할 수 있습니다.
단편 기반 스크리닝(FBS)은 학계와 산업계 모두에서 신약 개발 프로세스 내에서 잘 검증되고 인정되는 개념입니다. NMR 기반 단편 스크리닝의 가장 큰 장점은 7-8배 이상의 친화도 이상의 결합제를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 단편의 순도와 화학적 품질을 모니터링하여 고품질 히트와 최소한의 위양성 또는 위음성을 생성할 수 있다는 것입니다. FBS의 전제 조건은 단편 라이브러리의 초기 및 주기적 품질 관리를 수행하고, 관련 완충액에서 단편의 용해도 및 화학적 무결성을 결정하고, 다양한 거대분자 표적 클래스(단백질/RNA/DNA)를 수용하기 위해 다양한 스캐폴드를 포괄하는 여러 라이브러리를 구축하는 것입니다. 또한, 생물학적 구성물/단편 공간, 조건-공간(완충액, 첨가제, 이온, pH 및 온도) 및 리간드-공간(리간드 유사체, 리간드 농도) 수준에서 샘플 양, 획득 및 분석 속도에 대한 광범위한 NMR 기반 스크리닝 프로토콜 최적화가 필요합니다. 적어도 학계에서는 이러한 스크리닝 노력이 지금까지 매우 제한된 방식으로 수동으로 수행되어 약물 개발 프로세스뿐만 아니라 화학 프로브 개발의 맥락에서도 스크리닝 인프라의 가용성이 제한되었습니다. 경제적으로 요구 사항을 충족하기 위해 고급 워크 플로우가 제공됩니다. 그들은 액체 샘플 수집을 온도 제어 방식으로 NMR-튜브에 자동화된 방식으로 채울 수 있는 최신 최첨단 고급 하드웨어를 활용합니다. 1이어서, H/19FNMR 리간드-기반 스펙트럼을 주어진 온도에서 수집한다. 고처리량 시료 주입기(HT 시료 주입기)는 온도 제어 블록에서 500개 이상의 시료를 처리할 수 있습니다. 이는 고급 소프트웨어 도구와 함께 데이터 수집 및 분석 속도를 높입니다. 또한, 단백질 및 RNA 샘플에 대한 스크리닝 루틴의 적용은 생체 고분자 연구에서 광범위한 사용자 기반을 위해 확립된 프로토콜을 인식하기 위해 설명됩니다.
단편 기반 스크리닝은 이제 단백질, DNA 및 RNA를 포함한 거대분자 표적에 약한 결합을 보이는 다소 간단하고 저분자량 분자(MW <250Da)를 식별하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 1차 스크린으로부터의 초기 히트는 상업적으로 이용가능한 히트의 더 큰 유사체의 2차 스크린을 수행한 다음 화학 기반 단편 성장 또는 연결 전략을 활용하기 위한 기초 역할을 합니다. 성공적인 단편 기반 약물 발견(FBDD) 플랫폼을 위해서는 일반적으로 약한 적중, 단편 라이브러리, 생체 분자 표적 및 후속 화학 전략을 검출하고 특성화하기 위한 강력한 생물물리학적 방법이 필요합니다. 약물 발견 캠페인에서 일반적으로 적용되는 네 가지 생물물리학적 방법은 열 이동 분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 결정학 및 핵자기 공명 분광법(NMR)입니다.
NMR 분광법은 FBDD의 여러 단계에서 다양한 역할을 나타냈습니다. 최적화된 완충액 시스템에 용해된 단편 라이브러리에서 단편의 화학적 순도 및 용해도를 보장하는 것 외에도, 리간드 관찰 NMR 실험은 낮은 친화력으로 표적에 대한 단편 결합을 검출할 수 있고, 표적 관찰 NMR 실험은 단편의 결합 에피토프를 묘사할 수 있으므로 상세한 구조-활성 관계 연구가 가능합니다. 에피토프 매핑 내에서 NMR 기반 화학적 이동 변화는 오르토스테릭 결합 부위뿐만 아니라 생체 분자 표적의 소위 흥분된 형태 상태에서만 접근할 수 있고 비밀스러울 수 있는 알로스테릭 부위도 식별할 수 있습니다. 생체 분자 표적이 이미 내인성 리간드에 결합하는 경우, 확인된 단편 히트는 NMR 기반 경쟁 실험을 수행하여 알로스테릭 또는 오르토스테릭으로 쉽게 분류할 수 있습니다. 리간드-표적 상호작용의 해리 상수(KD)를 결정하는 것은 FBDD 공정에서 중요한 측면이다. NMR 기반 화학적 이동 적정은, 관찰된 리간드 또는 표적 중 어느 것이든, KD를 결정하기 위해 용이하게 수행될 수 있다. NMR의 주요 장점은 상호 작용 연구가 용액에서 생리적 조건에 가깝게 수행된다는 것입니다. 따라서 표적과의 리간드/단편 상호작용 분석을 위한 모든 구조적 상태를 조사할 수 있습니다. 또한, NMR 기반 접근법은 잘 접힌 가용성 단백질의 스크리닝으로 제한될 뿐만 아니라 DNA, RNA, 막 결합 및 본질적으로 무질서한 단백질을 포함한 더 큰 표적 공간을 수용하기 위해 적용되고 있습니다1.
프래그먼트 라이브러리는 FBDD 프로세스에서 없어서는 안될 부분입니다. 일반적으로, 단편은 초기 전구체로서 작용하며, 이는 결국 생물학적 표적을 위해 개발된 새로운 억제제의 일부(하부구조)가 된다. 여러 약물(베네토클락스2, 베무라페닙3, 에르다피티닙4, 펙시다르닙5)이 단편으로 시작하여 현재 클리닉에서 성공적으로 사용되는 것으로 보고되었습니다. 전형적으로, 단편은 높은 수성 용해도 및 안정성을 갖는 저분자량 (<250 Da) 유기 분자이다. 일반적으로 수백 개의 조각이 포함된 세심하게 제작된 조각 라이브러리는 이미 화학 공간의 효율적인 탐사를 약속할 수 있습니다. 단편 라이브러리의 일반적인 구성은 시간이 지남에 따라 발전해 왔으며 대부분 알려진 약물을 더 작은 조각으로 해부하거나 계산적으로 설계하여 파생되었습니다. 이러한 다양한 단편 라이브러리는 주로 편평한 방향족 또는 헤테로 원자를 포함하며 5 6의 리핀스키 규칙 또는 3 7의 현재 상업적 추세 규칙을 준수하지만 반응성 그룹은 피합니다. 일부 단편 라이브러리는 또한 고용해성 대사산물, 천연물 및/또는 이들의 유도체로 유도되거나 구성되었다8. 대부분의 단편 라이브러리가 제기하는 일반적인 과제는 다운스트림 화학의 용이성입니다.
프랑크푸르트 괴테대학교의 생체분자 자기공명 센터(BMRZ)는 생화학 및 생물의학 연구 분야의 모든 유럽 연구자들을 위한 구조 연구 인프라 컨소시엄인 iNEXT-Discovery(중개 연구-발견을 위한 NMR, EM 및 X-ray를 위한 인프라)의 파트너입니다. 2019년에 종료된 iNEXT의 이전 이니셔티브 내에서 768개의 조각으로 구성된 조각 라이브러리는 넓은 화학 공간을 포괄하는 “최소 조각과 최대 다양성”을 목표로 제작되었습니다. 또한, 다른 단편 라이브러리와 달리 iNEXT 단편 라이브러리는 복잡하고 친화성이 높은 리간드의 다운스트림 합성을 용이하게 하기 위해 “포이즈드 단편”이라는 개념을 기반으로 설계되었으며, 이후 사내 라이브러리(Diamond, Structural Genomic Consortium 및 iNEXT)로 알려져 있습니다.
NMR로 FBDD를 설정하려면 인력, 지식 및 계측이 필요합니다. BMRZ에서는 NMR에 의한 단편 스크리닝에 대한 기술 지원을 지원하기 위해 최적화된 워크플로우가 개발되었습니다. 여기에는 단편 라이브러리(9)의 품질 관리 및 용해도 평가, 선택된 표적에 대한 완충액 최적화, 1H 또는 19F-관찰된 1D-리간드 기반 스크리닝, 오르토스테릭 결합과 알로스테릭 결합을 구별하기 위한 경쟁 실험, 에피토프 맵핑을 위한 2D 기반 표적 관찰 NMR 실험 및 초기 단편 적중의 유도체의 2차 세트와의 상호작용을 특성화하기 위한 것이 포함된다. BMRZ는 이전에 문헌 10,11에서 논의된 바와 같이 소분자-단백질 상호작용의 분석을 위한 자동화된 루틴을 확립했으며 NMR 기반 단편 스크리닝에 필요한 모든 자동화된 인프라를 갖추고 있습니다. 포화 전달 차이 NMR(STD-NMR), 그래디언트 분광법(waterLOGSY)을 통해 관찰된 물-리간드, 광범위한 친화성 영역 내의 단편을 식별하기 위한 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 기반(CPMG 기반) 이완 실험을 구현했을 뿐만 아니라 약물 발견을 위한 최첨단 자동 NMR 기기 및 소프트웨어. NMR 기반 단편 스크리닝은 단백질에 대해 잘 확립되어 있지만, 이 접근법은 RNA 및 DNA와 상호 작용하는 새로운 리간드를 찾는 데 덜 일반적으로 사용됩니다. BMRZ는 소분자-RNA/DNA 상호작용을 식별할 수 있는 새로운 프로토콜에 대한 개념 증명을 확립했습니다. 이 기여의 다음 섹션에서는 단백질 및 RNA 샘플에 대한 스크리닝 루틴의 적용이 생체 고분자 연구의 광범위한 사용자 기반에 대해 확립된 프로토콜을 인식하는 것으로 보고되었습니다.
NMR 기반 단편/약물 스크리닝의 다양성. BMRZ는 약물 발견을 위한 광범위한 친화성 영역 내에서 단편을 식별하기 위해 STD-NMR, waterLOGSY 및 이완 실험뿐만 아니라 최첨단 자동 NMR 기기를 성공적으로 구현했습니다. 설치된 하드웨어에는 고처리량 시료 전처리 로봇과 600MHz 분광계와 관련된 고처리량 시료 저장, 교환기 및 데이터 수집 장치가 포함됩니다. 최근에 구입한 1H, 19F, 13C및 15N용 극저온 프로브는 제안된 측정에 필요한 감도를 보장하고 19F검출 중에 1H(1)디커플링을 허용합니다. 이 프로브는 CMC-q, CMC-assist, CMC-se 및 FBS(TopSpin에 포함됨)를 포함한 Bruker의 고급 소프트웨어 도구를 사용할 수 있는 최신 세대의 NMR 콘솔에 연결됩니다. 절편 기반 스크리닝(FBS) 도구는 최신 버전의 TopSpin에 포함되어 있으며 STD, waterLOGSY,T2/T1r-relaxation 실험으로 구성된 고처리량 데이터를 분석하는 데 도움이 됩니다. 액체 1D 1H 샘플 수집은 샘플 충전 로봇을 사용하여 자동화된 방식으로 NMR 튜브에 충전할 수 있습니다. 일반적으로 96개의 튜브(3mm) 블록이 약 2시간 내에 채워집니다. 96웰 플레이트 랙은 HT 샘플 체인저에 직접 배치되어 블록의 바코드를 판독하고 자동화 소프트웨어(IconNMR)에 의해 제어되는 실험에 NMR 튜브를 할당합니다. 5개의 96웰 플레이트 랙을 HT 자동 시료 주입기에 동시에 보관하고 프로그래밍할 수 있습니다. 각 개별 랙의 온도는 개별적으로 제어하고 조절할 수 있습니다. 또한 각 개별 시료는 측정 전에 원하는 온도로 사전 컨디셔닝(응축 습도 제거를 위한 예열 및 튜브 건조)할 수 있습니다.
광범위한 응용 분야에 적합합니다. 이 자동화된 NMR 기반 스크리닝의 광범위한 응용 분야 중 하나는 생체고분자 표적(DNA/RNA/단백질)에 결합하는 새로운 리간드를 식별하고 개발하는 것입니다. 이들 리간드는 전형적으로 비공유적으로 결합하는 오르토스테릭 및 알로스테릭 억제제를 포함할 수 있다. 또한, NMR에 의한 FBDD는 전형적으로 유망한 화합물을 선택하기 위한 제1 단계로서 사용되며, 충족되어야 하는 요건은 충분한 양의 생체분자 표적의 가용성이다. 이 목표는 두 가지 주요 작업으로 나뉩니다.
첫 번째 과제는 다음과 같은 이유로 사내 단편 라이브러리를 개발하고 특성화하는 것입니다 : 1000 개 이상의 단편의 초기 및 주기적 품질 관리, 특성화 및 정량화; 각 표적, 특히 단백질 표적에 대해 최적화된 완충액에서 단편의 용해도 측정; 다양한 스캐폴드를 수용하고 다른 거대분자 부류로 확장하기 위해 여러 라이브러리를 설립합니다. 작업 2는 다음을 사용하여 NMR에 의한 단편 기반 약물 설계(FBDD)를 위한 워크플로우를 통합하는 것입니다: 자동화된 1D-리간드 관찰 스크리닝(1H 및 19F관찰); orthosteric 및 allosteric 결합을 구별하기 위한 자동 교체 분석((천연) 리간드를 사용한 경쟁 실험); 여러 단편을 사용한 자동화된 2차 스크리닝; 자동화된 2D-단백질 스크리닝 및 EU-OPENSCREEN 라이브러리 또는 기타 라이브러리를 사용하는 초기 히트 주변의 유도체 세트의 2차 스크리닝; 선택한 대상에 대한 FDA 라이브러리의 재프로파일링 스크리닝.
또한, 세포주기 조절과 대사를 연결하는 조절 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 세포주(질병 관련)의 대사형 분석이 수행될 수 있습니다. 또한, 구축물/도메인 최적화(구조 조사(완충액, pH, 온도 및 염 스크리닝)를 위한 안정성 최적화)의 최적화를 위한 생체 내 및 시험관 내에서 RNA/DNA/단백질 조절 요소의 기능적 특성화와 일반적으로 다른 기술로는 접근할 수 없는 막 단백질 및 본질적으로 무질서한 단백질에 대한 NMR 기반 단편 스크리닝의 확장이 있습니다.
제한. 19F 및 1H 단편 라이브러리의 사용에는 장단점이 있으며, 그 중 일부는 다음에서 언급 할 것입니다. 19F대 1H측정의 가장 큰 이점은 혼합물에 거의 두 배의 단편이 포함되어 있고 더 적은 수의 실험을 수행해야 하기 때문에 실제 측정 시간과 후속 분석의 속도입니다. 또한 버퍼의 간섭이 없고 최적으로 설계된 단편 혼합물에 대해 신호 겹침이 거의 없는 더 넓은 화학적 이동 범위를 추가로 제공하기 때문에 19F스크리닝의 경우 후속 분석이 더 쉽습니다. 스펙트럼 자체는 크게 단순화되어 일반적으로 불소 원자의 수에 따라 단편당 하나 또는 두 개의 신호만 갖습니다. 따라서 이러한 스펙트럼의 분석을 자동화하여 시간을 단축할 수 있습니다. 이것은 적어도이 연구에 사용 된 도서관에 대한 화학적 다양성을 희생시켜줍니다. 라이브러리의 ~13%만이 19F를 포함하고 있지만 당연히 모두 1H 스크리닝에 사용할 수 있으므로 19F스크리닝 조각의 다양성은 더 낮아집니다. 이것은 더 많은 조각과 더 큰 화학적 다양성을 가진 특별히 설계된 19F라이브러리를 사용하여 우회할 수 있습니다. 19F스크리닝의 또 다른 단점은 단편당 신호 수가 적다는 것입니다. 단편은 일반적으로 하나 이상의 수소 원자로 구성된다. 따라서 1H관찰 스크리닝 실험은 결합을 검출하기 위해 동일한 단편에 대해 서로 다른 신호에 의존할 수 있습니다. 이는 1H 스크리닝에 대한 히트를 식별할 때 더 높은 신뢰도를 제공하는 반면, 19F스크리닝은 단편당 주어진 하나 또는 두 개의 신호에 의존해야 합니다.
현대의 자동화된 NMR 기반 단편 스크리닝 기기, 소프트웨어 및 분석 방법 및 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제시되었습니다. 설치된 하드웨어에는 고처리량 시료 전처리 로봇과 600MHz 분광계와 관련된 고처리량 시료 저장, 교환기 및 데이터 수집 장치가 포함됩니다. 최근에 설치된 1 H, 19 F, 13 C 및 15N용 극저온 프로브 헤드는 제안된 측정에 필요한 감도를 보장하고 19F 검출 중에 1H 디커플링을 허용합니다. 또한 최신 세대의 NMR 콘솔은 획득 및 즉석 분석을 지원하기 위해 고급 분석 소프트웨어를 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 위에서 논의한 기술, 워크플로 및 설명된 프로토콜은 NMR에 의해 FBS를 추구하는 사용자에게 놀라운 성공을 촉진할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 Horizon 2020 프로그램에서 자금을 지원하는 프로젝트 번호 871037인 iNEXT-Discovery의 지원을 받았습니다.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |