核磁共振基于片段的筛选是快速鉴定生物大分子(DNA、RNA或蛋白质)的小分子结合剂的可靠方法。介绍了描述基于自动化的样品制备、NMR 实验和采集条件以及分析工作流程的协议。该技术允许对 1H和 19F NMR活性细胞核进行最佳利用以进行检测。
基于片段的筛选(FBS)在学术界和工业界的药物发现过程中都是一个经过充分验证和接受的概念。基于核磁共振的片段筛选的最大优势在于它不仅能够检测超过7-8个数量级亲和力的结合剂,而且还能够监测片段的纯度和化学质量,从而产生高质量的命中率和最小的假阳性或假阴性。FBS的先决条件是对片段库进行初始和定期质量控制,确定片段在相关缓冲液中的溶解度和化学完整性,并建立多个文库以覆盖不同的支架以适应各种大分子靶标类别(蛋白质/RNA/DNA)。此外,需要在生物构建/片段空间、条件空间(缓冲液、添加剂、离子、pH 和温度)和配体空间(配体类似物、配体浓度)水平上对样品数量、采集和分析速度进行广泛的基于 NMR 的筛选方案优化。至少在学术界,到目前为止,这些筛选工作是以非常有限的方式手动进行的,导致筛选基础设施的可用性有限,不仅在药物开发过程中,而且在化学探针开发的背景下。为了经济地满足要求,提出了先进的工作流程。它们利用最新的先进硬件,通过这些硬件,液体样品收集可以以温控方式自动填充到NMR管中。 1然后在给定温度下收集基于H / 19F NMR配体的光谱。高通量自动进样器(HT 自动进样器)可在温控块中处理 500 多个样品。这与先进的软件工具相结合,加快了数据采集和分析的速度。此外,还描述了在蛋白质和RNA样品上应用筛选程序,以了解生物大分子研究中广泛用户群的既定方案。
基于片段的筛选现在是一种常用的方法,用于鉴定相当简单和低分子量的分子(MW <250 Da),这些分子与包括蛋白质,DNA和RNA在内的大分子靶标的结合较弱。来自主筛选的初始命中作为对市售的较大命中类似物进行二次筛选的基础,然后利用基于化学的片段生长或连接策略。对于成功的基于片段的药物发现(FBDD)平台,通常需要一种强大的生物物理方法来检测和表征弱命中,片段库,生物分子靶标和后续化学策略。药物发现活动中常用的四种生物物理方法是热位移测定、表面等离子体共振(SPR)、晶体学和核磁共振波谱(NMR)。
核磁共振波谱在FBDD的不同阶段显示出不同的作用。除了确保溶解在优化缓冲液系统中的片段库中片段的化学纯度和溶解度外,配体观察的NMR实验还可以检测片段与低亲和力靶标的结合,并且靶标观察到的NMR实验可以描绘片段的结合表位,从而实现详细的构效关系研究。在表位作图中,基于NMR的化学位移变化不仅可以识别正位结合位点,还可以识别可能神秘的变构位点,并且只能在生物分子靶标的所谓激发构象状态下才能访问。如果生物分子靶标已经结合内源性配体,则通过执行基于NMR的竞争实验,可以很容易地将鉴定的片段命中分为变构或正位。确定配体-靶点相互作用的解离常数(KD)是FBDD过程中的一个重要方面。基于NMR的化学位移滴定,无论是配体还是靶标,都可以很容易地进行,以确定 KD。核磁共振的一个主要优点是相互作用研究是在溶液中和接近生理条件进行的。因此,可以探测用于分析配体/片段与其靶标相互作用的所有构象状态。此外,基于核磁共振的方法不仅仅限于筛选折叠良好的可溶性蛋白质,而且还被用于适应更大的靶标空间,包括DNA、RNA、膜结合和固有无序蛋白质1。
片段库是 FBDD 流程中不可或缺的一部分。通常,片段充当初始前体,最终成为为生物靶标开发的新抑制剂的一部分(亚结构)。据报道,几种药物(维奈托克2,维莫非尼3,艾达非替尼4,Pexidartnib5)已以片段形式开始,现已成功用于临床。通常,片段是具有高水溶性和稳定性的低分子量(<250Da)有机分子。一个精心制作的片段库通常包含几百个片段,已经可以保证对化学空间的有效探索。片段库的一般组成随着时间的推移而发展,通常是通过将已知药物解剖成更小的片段或计算设计得出的。这些不同的片段库主要包含扁平芳烃或杂原子,并遵循Lipinski规则5 6或当前商业趋势规则 3 7,但避免反应性基团。一些片段库也衍生或由高度可溶的代谢物、天然产物和/或其衍生物组成8。大多数片段库带来的一个普遍挑战是易于下游化学。
法兰克福歌德大学生物分子磁共振中心(BMRZ)是iNEXT-Discovery(用于转化研究发现的核磁共振,EM和X射线基础设施)的合作伙伴,iNEXT-Discovery是一个为来自所有生物化学和生物医学研究领域的所有欧洲研究人员提供结构研究基础设施的联盟。在iNEXT于2019年结束的先前计划中,制作了一个由768个片段组成的片段库,旨在覆盖广阔的化学空间,以实现“最小片段和最大多样性”。此外,与任何其他片段库不同,iNEXT片段库也是基于“准备片段”的概念设计的,旨在简化复杂、高亲和力配体的下游合成,此后称为内部文库(Diamond、Structural Genomic Consortium和iNEXT)。
通过核磁共振建立FBDD需要人力、知识和仪器。在BMRZ,已经开发了优化的工作流程,以支持通过NMR进行片段筛选的技术援助。这些包括片段库 9的质量控制和溶解度评估,所选靶标的缓冲液优化,基于 1H或19 F-观察的 1D配体筛选,区分正位和变构结合的竞争实验,基于2D的靶标观察NMR实验用于表位定位,以及表征与初始片段命中的二级衍生物集的相互作用。BMRZ已经建立了用于分析小分子-蛋白质相互作用的自动化程序,正如之前在文献 10,11中所讨论的那样,并为基于NMR的片段筛选提供了所有必要的自动化基础设施。它已经实施了饱和转移差核磁共振(STD-NMR),通过梯度光谱(waterLOGSY)观察的水配体,以及基于Carr-Purcell-Meiboom-Gill(基于CPMG)的弛豫实验,以鉴定各种亲和力范围内的片段,以及最先进的自动化核磁共振仪器和用于药物发现的软件。虽然基于NMR的片段筛选已经很好地用于蛋白质,但这种方法不太常用于寻找与RNA和DNA相互作用的新配体。BMRZ已经为能够识别小分子RNA/DNA相互作用的新方案建立了概念验证。在本贡献的以下部分中,报告了蛋白质和RNA样品筛选程序的应用,以了解生物大分子研究中广泛用户群的既定方案。
基于 NMR 的片段/药物筛选的多功能性。BMRZ已成功实施了最先进的自动化核磁共振仪器以及STD-NMR,waterLOGSY和松弛实验,以鉴定药物发现的各种亲和力范围内的片段。安装的硬件包括一个高通量样品制备机器人和与 600 MHz 光谱仪相关的高通量样品存储、更换器和数据采集单元。最近购买的用于 1H、19F、13C 和 15N 的低温探头可确保建议测量所需的灵敏度,并允许在 19F 检测期间进行 1 H (1) 去耦。该探头连接到最新一代的核磁共振控制台,可以使用布鲁克的高级软件工具,包括CMC-q、CMC-assist、CMC-se和FBS(包含在TopSpin中)。基于片段的筛选(FBS)工具包含在最新版本的TopSpin中,有助于分析高通量数据,包括STD,waterLOGSY,T2 / T1r-弛豫实验。液体1D 1H样品收集可以通过使用样品填充机器人以自动方式填充到NMR管中。 通常,在大约两个小时内填充96个管(3毫米)的块。96孔板架直接放置在HT自动进样器中,该自动进样器读取模块的条形码并将NMR管分配给由自动化软件(IconNMR)控制的实验。五个 96 孔板架可以同时在 HT 自动进样器中存储和编程。每个机架的温度可以单独控制和调节。此外,在测量前,可以将每个单独的样品预处理(预热和管干燥以去除冷凝湿度)到所需的温度。
适用于广泛的应用。 这种基于核磁共振的自动化筛选的广泛应用之一是鉴定和开发与生物大分子靶标(DNA/RNA/蛋白质)结合的新型配体。这些配体可以包括通常非共价结合的正位和变构抑制剂。此外,通过核磁共振进行的FBDD通常用作选择有前途的化合物的第一步,要满足的要求是足够数量的生物分子靶标的可用性。这一目标分为两个主要任务。
任务一是开发和表征内部片段库,原因如下:1000多个片段的初始和定期质量控制、表征和定量;测定片段在针对每个靶标优化的缓冲液中的溶解度,特别是针对蛋白质靶标;以及建立几个文库以容纳不同的支架并扩展到其他大分子类别。任务二是通过核磁共振整合基于片段的药物设计(FBDD)的工作流程,使用:自动1D配体观察筛选(观察到1H和 19F);自动替代测定(与(天然)配体竞争实验)以区分正位和变构结合;具有多个片段的自动二次筛选;自动2D蛋白筛选,以及利用EU-OPENSCREEN文库或任何其他文库围绕初始命中对一组衍生物进行二次筛选;以及针对所选靶标对FDA图书馆进行重新剖析筛选。
此外,可以进行各种细胞系(疾病相关)的代谢分型,以揭示连接细胞周期控制和代谢的调节机制。此外,还可以在 体内 和体外对RNA/DNA/蛋白质调控元件进行功能表征,以优化构建 体 /结构域优化(结构研究的稳定性优化(缓冲液、pH、温度和盐筛选),并将基于NMR的片段筛选扩展到膜蛋白和固有无序蛋白,这通常是其他技术无法实现的。
局限性。 使用 19F 和 1H 片段库有其优点和缺点,下文将很少提及。与 1H 相比,19F 测量的最大优势是实际测量时间和后续分析的速度,因为混合物包含的片段数量几乎是其两倍,并且必须进行的实验更少。后续分析对于19F筛选也更容易,因为没有缓冲液的干扰,此外,对于最佳设计的片段混合物,提供了更宽的化学位移范围,几乎没有信号重叠。光谱本身大大简化,通常每个片段只有一个或两个信号,具体取决于氟原子的数量。因此,这些光谱的分析可以自动化,再次减少时间。这是以化学多样性为代价的,至少对于本研究中使用的图书馆而言。由于只有~13%的文库包含19 F,但自然所有这些都可用于1H筛选,因此19F筛选片段的多样性会更低。这可以通过专门设计的19F文库来规避,这些文库具有更多的片段和更大的化学多样性。19F筛选的另一个缺点是每个片段的信号数量少。片段通常由一个以上的氢原子组成。因此,1H观察到的筛选实验可以依靠同一片段的不同信号来检测结合。这在识别1H筛选的命中时提供了更高的置信度,而19F筛选必须依赖于每个片段给出的一个或两个信号。
本文详细介绍了基于核磁共振的现代自动化片段筛选仪器、软件和分析方法及其协议。安装的硬件包括一个高通量样品制备机器人和一个与 600 MHz 光谱仪相关的高通量样品存储、更换器和数据采集单元。最近安装的 1 H、19F、13C 和 15N 低温探头可确保建议测量所需的灵敏度,并允许在 19F 检测期间进行 1H 去耦。此外,最新一代的核磁共振控制台提供了使用高级分析软件辅助采集和动态分析的可能性。上面讨论的技术、工作流程和所描述的协议应该会为追求核磁共振FBS的用户带来显著的成功。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了iNEXT-Discovery的支持,项目编号为871037,由欧盟委员会的地平线2020计划资助。
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |