A triagem baseada em fragmentos por RMN é um método robusto para identificar rapidamente ligantes de pequenas moléculas a biomacromoléculas (DNA, RNA ou proteínas). Protocolos descrevendo a preparação de amostras baseada em automação, experimentos de RMN e condições de aquisição e fluxos de trabalho de análise são apresentados. A técnica permite a exploração ideal de núcleos ativos de RMN de 1H e 19F para detecção.
A triagem baseada em fragmentos (FBS) é um conceito bem validado e aceito dentro do processo de descoberta de medicamentos, tanto na academia quanto na indústria. A maior vantagem da triagem de fragmentos baseada em RMN é sua capacidade não apenas de detectar ligantes acima de 7-8 ordens de magnitude de afinidade, mas também de monitorar a pureza e a qualidade química dos fragmentos e, assim, produzir acertos de alta qualidade e mínimos falsos positivos ou falsos negativos. Um pré-requisito dentro do FBS é realizar o controle de qualidade inicial e periódico da biblioteca de fragmentos, determinando a solubilidade e a integridade química dos fragmentos em buffers relevantes e estabelecendo várias bibliotecas para cobrir diversos arcabouços para acomodar várias classes alvo de macromoléculas (proteínas/RNA/DNA). Além disso, uma extensa otimização do protocolo de triagem baseada em RMN com relação às quantidades de amostra, velocidade de aquisição e análise no nível de construto biológico/espaço de fragmento, no espaço de condição (tampão, aditivos, íons, pH e temperatura) e no espaço ligante (análogos do ligante, concentração do ligante) é necessária. Pelo menos no meio acadêmico, esses esforços de triagem até agora foram realizados manualmente de forma muito limitada, levando a uma disponibilidade limitada de infraestrutura de triagem não apenas no processo de desenvolvimento de medicamentos, mas também no contexto do desenvolvimento de sondas químicas. A fim de atender aos requisitos economicamente, fluxos de trabalho avançados são apresentados. Eles aproveitam o mais recente hardware avançado de última geração, com o qual a coleta de amostras líquidas pode ser preenchida de forma controlada por temperatura nos tubos de RMN de maneira automatizada. 1ºOs espectros baseados em ligantes de RMN H/19F são então coletados a uma dada temperatura. O trocador de amostras de alto rendimento (trocador de amostras HT) pode lidar com mais de 500 amostras em blocos com temperatura controlada. Isso, juntamente com ferramentas avançadas de software, acelera a aquisição e análise de dados. Além disso, a aplicação de rotinas de triagem em amostras de proteína e RNA são descritas para tornar ciente dos protocolos estabelecidos para uma ampla base de usuários em pesquisa biomacromolecular.
A triagem baseada em fragmentos é atualmente um método comumente usado para identificar moléculas bastante simples e de baixo peso molecular (MW <250 Da) que mostram ligação fraca a alvos macromoleculares, incluindo proteínas, DNA e RNA. Os acertos iniciais das telas primárias servem como base para conduzir uma tela secundária de análogos maiores disponíveis comercialmente dos hits e, em seguida, utilizar estratégias de crescimento ou ligação de fragmentos baseadas em química. Para uma plataforma de descoberta de fármacos baseada em fragmentos (FBDD) bem-sucedida, em geral, um método biofísico robusto é necessário para detectar e caracterizar acertos fracos, uma biblioteca de fragmentos, um alvo biomolecular e uma estratégia para acompanhamento químico. Quatro métodos biofísicos comumente aplicados dentro das campanhas de descoberta de fármacos são ensaios de deslocamento térmico, ressonância plasmônica de superfície (SPR), cristalografia e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN).
A espectroscopia de RMN tem mostrado papéis variados dentro dos diferentes estágios do FBDD. Além de garantir a pureza química e a solubilidade dos fragmentos em uma biblioteca de fragmentos dissolvidos em um sistema tampão otimizado, os experimentos de RMN observados por ligantes podem detectar a ligação de fragmentos a um alvo com baixa afinidade e os experimentos de RMN observados no alvo podem delinear o epítopo de ligação do fragmento, permitindo estudos detalhados da relação estrutura-atividade. Dentro do mapeamento de epítopos, as mudanças de deslocamento químico baseadas em RMN não identificam apenas os sítios de ligação ortostérica, mas também os sítios alostéricos que podem ser crípticos e acessíveis apenas nos chamados estados conformacionais excitados do alvo biomolecular. Se o alvo biomolecular já se liga a um ligante endógeno, os acertos do fragmento identificado podem ser facilmente classificados como alostéricos ou ortostéricos através da realização de experimentos de competição baseados em RMN. A determinação da constante de dissociação (KD) da interação ligante-alvo é um aspecto importante no processo de FBDD. Titulações de deslocamento químico baseadas em RMN, tanto ligante quanto alvo observado, podem ser prontamente realizadas para determinar a KD. Uma grande vantagem da RMN é que os estudos de interação são realizados em solução e próximos a condições fisiológicas. Assim, todos os estados conformacionais para a análise da interação ligante/fragmento com seu alvo podem ser sondados. Além disso, as abordagens baseadas em RMN não são apenas restritas à triagem de proteínas solúveis bem dobradas, mas também estão sendo aplicadas para acomodar um espaço alvo maior, incluindo DNA, RNA, proteínas ligadas à membrana e intrinsecamente desordenadas1.
As bibliotecas de fragmentos são uma parte indispensável do processo FBDD. Em geral, os fragmentos atuam como precursores iniciais que eventualmente se tornam parte (subestrutura) do novo inibidor desenvolvido para um alvo biológico. Vários medicamentos (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) foram relatados como tendo começado como fragmentos e agora são usados com sucesso nas clínicas. Tipicamente, os fragmentos são moléculas orgânicas de baixo peso molecular (<250 Da) com alta solubilidade aquosa e estabilidade. Uma biblioteca de fragmentos cuidadosamente elaborada, contendo tipicamente algumas centenas de fragmentos, já pode prometer uma exploração eficiente do espaço químico. A composição geral das bibliotecas de fragmentos evoluiu ao longo do tempo e, na maioria das vezes, foi derivada dissecando drogas conhecidas em fragmentos menores ou projetados computacionalmente. Essas diversas bibliotecas de fragmentos contêm principalmente aromáticos planos ou heteroátomos e aderem à Regra de Lipinski de 5 6, ou à Regra de tendência comercial atual de 3 7, mas evitam grupos reativos. Algumas bibliotecas de fragmentos também foram derivadas ou compostas por metabólitos altamente solúveis, produtos naturais e/ou seus derivados8. Um desafio geral colocado pela maioria das bibliotecas de fragmentos é a facilidade da química a jusante.
O Centro de Ressonância Magnética Biomolecular (BMRZ) da Goethe-University Frankfurt, é parceiro do iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), um consórcio de infraestruturas de investigação estrutural para todos os investigadores europeus de todas as áreas da investigação bioquímica e biomédica. Dentro da iniciativa anterior do iNEXT, que terminou em 2019, uma biblioteca de fragmentos composta por 768 fragmentos foi criada com o objetivo de “fragmentos mínimos e diversidade máxima” cobrindo um grande espaço químico. Além disso, ao contrário de qualquer outra biblioteca de fragmentos, a biblioteca de fragmentos iNEXT também foi projetada com base no conceito de “fragmentos equilibrados” com o objetivo de facilitar a síntese a jusante de ligantes complexos e de alta afinidade e, doravante, conhecida como biblioteca interna (Diamond, Structural Genomic Consortium e iNEXT).
Estabelecer FBDD por RMN requer mão de obra, conhecimento e instrumentação. Na BMRZ, foram desenvolvidos fluxos de trabalho otimizados para dar suporte à assistência técnica à triagem de fragmentos por RMN. Estes incluem controle de qualidade e avaliação da solubilidade da biblioteca de fragmentos 9, otimização de buffer para os alvos escolhidos, triagem baseada em ligantes 1D observados em 1H ou 19F, experimentos de competição para diferenciar entre ligação ortostérica e alostérica, experimentos de RMN observados em alvos baseados em 2D para mapeamento de epítopos e para caracterizar a interação com um conjunto secundário de derivados dos acertos iniciais dos fragmentos. A BMRZ estabeleceu rotinas automatizadas para a análise, como também discutido anteriormente na literatura 10,11, de interações molécula-proteína de pequeno porte e possui toda a infraestrutura automatizada necessária para a triagem de fragmentos baseada em RMN. Ele implementou a NMR POR DIFERENÇA DE TRANSFERÊNCIA DE SATURAÇÃO (STD-NMR), ligante de água observado via espectroscopia de gradiente (waterLOGSY) e experimentos de relaxamento baseados em Carr-Purcell-Meiboom-Gill (baseados em CPMG) para identificar fragmentos dentro de uma ampla gama de regimes de afinidade, bem como instrumentação de RMN automatizada de última geração e software para descoberta de drogas. Enquanto a triagem de fragmentos baseada em RMN está bem estabelecida para proteínas, essa abordagem é menos comumente usada para encontrar novos ligantes interagindo com RNA e DNA. A BMRZ estabeleceu uma prova de conceito para novos protocolos que permitem a identificação de interações RNA/DNA de pequenas moléculas. Nas seções seguintes desta contribuição, a aplicação de rotinas de triagem em amostras de proteína e RNA é relatada para dar conhecimento aos protocolos estabelecidos para uma ampla base de usuários em pesquisa biomacromolecular.
Versatilidade da triagem de fragmentos/fármacos baseada em RMN. A BMRZ implementou com sucesso instrumentação de RMN automatizada de última geração, bem como experimentos de RMN STD, waterLOGSY e relaxamento para identificar fragmentos dentro de uma ampla gama de regimes de afinidade para a descoberta de drogas. O hardware instalado inclui um robô de preparação de amostras de alto rendimento e armazenamento de amostras de alto rendimento, trocador e unidade de aquisição de dados associados a um espectrômetro de 600 MHz. Uma sonda criogênica recém-adquirida para 1 H, 19 F, 13C e 15 N garante a sensibilidade necessária para as medições propostas e permite o desacoplamento de1 H (1) durante a detecção de 19F. Esta sonda está conectada à última geração de console NMR que oferece a possibilidade de usar as ferramentas avançadas de software da Bruker, incluindo CMC-q, CMC-assist, CMC-se e FBS (incluído no TopSpin). A ferramenta de triagem baseada em fragmentos (FBS) está incluída na versão mais recente do TopSpin e ajuda a analisar os dados de alto rendimento que compreendem experimentos de relaxamento r STD, waterLOGSY, T2/T1. A coleta de amostras líquidas 1D 1H pode ser preenchida nos tubos de RMN de forma automatizada usando o robô de enchimento de amostras. Normalmente, um bloco de 96 tubos (3 mm) é preenchido em aproximadamente duas horas. Os racks de placas de 96 poços são posicionados diretamente no trocador de amostras HT, que lê o código de barras do bloco e atribui os tubos de RMN aos experimentos controlados pelo software de automação (IconNMR). Cinco racks de placas de 96 poços podem ser armazenados e programados no trocador de amostras HT ao mesmo tempo. A temperatura de cada um dos racks individuais pode ser controlada e regulada separadamente. Além disso, cada amostra individual pode ser pré-condicionada (pré-aquecimento e secagem do tubo para remoção da umidade condensada) à temperatura desejada antes da medição.
Adequação para uma ampla gama de aplicações. Uma das amplas aplicações dessa triagem automatizada baseada em RMN é identificar e desenvolver novos ligantes que se ligam a um alvo biomacromolecular (DNA/RNA/proteínas). Esses ligantes podem incluir inibidores ortostéricos e alostéricos que tipicamente se ligam de forma não covalente. Além disso, FBDD por RMN é tipicamente usado como um primeiro passo para selecionar compostos promissores, os requisitos a serem atendidos são a disponibilidade do alvo biomolecular em quantidades suficientes. Este objectivo divide-se em duas grandes tarefas.
A primeira tarefa é desenvolver e caracterizar uma biblioteca interna de fragmentos pelos seguintes motivos: controle de qualidade inicial e periódico, caracterização e quantificação de mais de 1000 fragmentos; determinação da solubilidade dos fragmentos em tampões otimizados para cada alvo, em particular para alvos proteicos; e o estabelecimento de várias bibliotecas para acomodar diversos arcabouços e estendendo-se para outras classes de macromoléculas. A segunda tarefa é integrar fluxos de trabalho para planejamento de fármacos baseado em fragmentos (FBDD) por RMN usando: triagem observada automatizada de ligantes 1D (1H e 19F observados); ensaios automatizados de substituição (experimentos de competição com ligante (natural) para diferenciar ligação ortostérica e alostérica; rastreios secundários automatizados com múltiplos fragmentos; rastreio automatizado de proteínas 2D e rastreio secundário de um conjunto de derivados em torno de um acerto inicial, utilizando a biblioteca EU-OPENSCREEN ou qualquer outra biblioteca; e reperfilamento da biblioteca da FDA em relação aos alvos escolhidos.
Adicionalmente, a metabotipagem de várias linhagens celulares (doença relevante) pode ser conduzida a fim de desvendar os mecanismos regulatórios que ligam o controle do ciclo celular e o metabolismo. Além disso, há caracterização funcional de elementos de regulação de RNA/DNA/proteínas in vivo e in vitro para otimização de construto/domínio (otimização de estabilidade para investigações estruturais (tampão, pH, temperatura e triagem salina), e uma extensão da triagem de fragmentos baseada em RMN para proteínas de membrana e proteínas intrinsecamente desordenadas, que geralmente são inacessíveis a outras técnicas.
Limitações. O uso de bibliotecas de fragmentos 19F e 1H tem seus prós e contras, poucos dos quais serão mencionados a seguir. O maior benefício das medições de 19F versus 1H é a velocidade do tempo de medição real e da análise subsequente, já que as misturas contêm quase o dobro do número de fragmentos e menos experimentos devem ser realizados. A análise de acompanhamento também é mais fácil para a triagem de 19F, pois não há interferência de buffers e, adicionalmente, oferece uma faixa de deslocamento químico mais ampla com quase nenhuma sobreposição de sinal para uma mistura de fragmentos idealmente projetada. Os espectros em si são muito simplificados, geralmente tendo apenas um ou dois sinais por fragmento, dependendo do número de átomos de flúor. A análise desses espectros pode, portanto, ser automatizada, novamente reduzindo o tempo. Isso tem o custo da diversidade química, pelo menos para a biblioteca usada neste estudo. Como apenas ~13% da biblioteca contém 19 F, mas naturalmente todos eles são utilizáveis na triagem de 1H, a diversidade dos fragmentos de triagem de 19F será menor. Isso poderia ser contornado usando bibliotecas 19F especificamente projetadas com mais fragmentos e maior diversidade química. Outra desvantagem para a triagem de 19F é o baixo número de sinais por fragmento. Os fragmentos geralmente são compostos por mais de um átomo de hidrogênio. Portanto, experimentosde triagem observados em 1 H podem contar com sinais diferentes para o mesmo fragmento para detectar ligação. Isso dá um maior grau de confiança ao identificar acertos para a triagem de 1H, enquanto a triagem de 19F deve se basear em um ou dois sinais dados por fragmento.
Um relato detalhado sobre a moderna instrumentação automatizada de triagem de fragmentos baseada em RMN, software e métodos de análise e protocolos dos mesmos foi apresentado. O hardware instalado inclui um robô de preparação de amostras de alto rendimento e uma unidade de armazenamento, trocador e aquisição de dados de amostras de alto rendimento associada a um espectrômetro de 600 MHz. Uma cabeça de sonda criogênica recentemente instalada para 1 H, 19 F, 13 C e 15 N garante a sensibilidade necessária para as medições propostas e permite o desacoplamento de 1H durante a detecção de 19F. Além disso, a última geração de console de RMN oferece a possibilidade de usar software analítico avançado para auxiliar a aquisição e análise em tempo real. A tecnologia discutida acima, os fluxos de trabalho e os protocolos descritos devem promover um sucesso notável para os usuários que buscam FBS por RMN.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo iNEXT-Discovery, projeto número 871037, financiado pelo programa Horizonte 2020 da Comissão Europeia.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |