El cribado basado en fragmentos mediante RMN es un método robusto para identificar rápidamente aglutinantes de moléculas pequeñas a biomacromoléculas (ADN, ARN o proteínas). Se presentan protocolos que describen la preparación de muestras basada en la automatización, los experimentos de RMN y las condiciones de adquisición, y los flujos de trabajo de análisis. La técnica permite la explotación óptima de núcleos activos de RMN de 1H y 19F para su detección.
El cribado basado en fragmentos (FBS) es un concepto bien validado y aceptado dentro del proceso de descubrimiento de fármacos tanto en la academia como en la industria. La mayor ventaja del cribado de fragmentos basado en RMN es su capacidad no solo para detectar aglutinantes de más de 7-8 órdenes de magnitud de afinidad, sino también para monitorear la pureza y la calidad química de los fragmentos y, por lo tanto, producir aciertos de alta calidad y falsos positivos o falsos negativos mínimos. Un requisito previo dentro del FBS es realizar un control de calidad inicial y periódico de la biblioteca de fragmentos, determinar la solubilidad y la integridad química de los fragmentos en tampones relevantes y establecer múltiples bibliotecas para cubrir diversos andamios para acomodar varias clases de macromoléculas objetivo (proteínas / ARN / ADN). Además, se requiere una amplia optimización del protocolo de cribado basado en RMN con respecto a las cantidades de muestra, la velocidad de adquisición y el análisis a nivel de constructo/fragmento-espacio biológico, en el espacio de condiciones (tampón, aditivos, iones, pH y temperatura) y en el espacio del ligando (análogos de ligandos, concentración de ligandos). Al menos en el mundo académico, estos esfuerzos de detección hasta ahora se han llevado a cabo manualmente de manera muy limitada, lo que lleva a una disponibilidad limitada de infraestructura de detección no solo en el proceso de desarrollo de medicamentos sino también en el contexto del desarrollo de sondas químicas. Para cumplir con los requisitos de forma económica, se presentan flujos de trabajo avanzados. Aprovechan el último hardware avanzado de última generación, con el que la recolección de muestras líquidas se puede llenar de manera controlada por temperatura en los tubos de RMN de manera automatizada. 1Los espectros basados en ligandos de RMN H/19F se recogen a una temperatura dada. El cambiador de muestras de alto rendimiento (cambiador de muestras HT) puede manejar más de 500 muestras en bloques de temperatura controlada. Esto, junto con herramientas de software avanzadas, acelera la adquisición y el análisis de datos. Además, se describe la aplicación de rutinas de cribado en muestras de proteínas y ARN para conocer los protocolos establecidos para una amplia base de usuarios en la investigación biomacromolecular.
El cribado basado en fragmentos es ahora un método comúnmente utilizado para identificar moléculas bastante simples y de bajo peso molecular (MW <250 Da) que muestran una unión débil a objetivos macromoleculares que incluyen proteínas, ADN y ARN. Los golpes iniciales de las pantallas primarias sirven como base para realizar una pantalla secundaria de análogos más grandes disponibles comercialmente de los golpes y luego para utilizar estrategias de crecimiento de fragmentos o enlaces basadas en la química. Para una plataforma exitosa de descubrimiento de fármacos basados en fragmentos (FBDD), en general, se requiere un método biofísico robusto para detectar y caracterizar golpes débiles, una biblioteca de fragmentos, un objetivo biomolecular y una estrategia para la química de seguimiento. Cuatro métodos biofísicos comúnmente aplicados dentro de las campañas de descubrimiento de fármacos son los ensayos de desplazamiento térmico, la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la cristalografía y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN).
La espectroscopia de RMN ha mostrado diversos roles dentro de las diferentes etapas del FBDD. Además de garantizar la pureza química y la solubilidad de los fragmentos en una biblioteca de fragmentos disueltos en un sistema tampón optimizado, los experimentos de RMN observados por ligandos pueden detectar la unión de fragmentos a un objetivo con baja afinidad y los experimentos de RMN observados pueden delinear el epítopo de unión del fragmento, lo que permite estudios detallados de la relación estructura-actividad. Dentro del mapeo de epítopos, los cambios de desplazamiento químico basados en RMN no solo pueden identificar los sitios de unión ortostérica, sino también los sitios alostéricos que podrían ser crípticos y solo accesibles en los llamados estados conformacionales excitados del objetivo biomolecular. Si el objetivo biomolecular ya se une a un ligando endógeno, los impactos del fragmento identificados se pueden clasificar fácilmente como alostéricos u ortostéricos mediante la realización de experimentos de competencia basados en RMN. La determinación de la constante de disociación (KD) de la interacción ligando-objetivo es un aspecto importante en el proceso FBDD. Las titulaciones de desplazamiento químico basadas en RMN, ya sea ligando u objetivo observado, se pueden realizar fácilmente para determinar el K D. Una ventaja importante de la RMN es que los estudios de interacción se realizan en solución y cerca de condiciones fisiológicas. Por lo tanto, todos los estados conformacionales para el análisis de la interacción ligando/fragmento con su objetivo pueden ser probados. Además, los enfoques basados en RMN no solo se limitan a la detección de proteínas solubles bien plegadas, sino que también se están aplicando para acomodar un espacio objetivo más grande, incluyendo ADN, ARN, proteínas unidas a membrana e intrínsecamente desordenadas1.
Las bibliotecas de fragmentos son una parte indispensable del proceso FBDD. En general, los fragmentos actúan como los precursores iniciales que eventualmente se convierten en parte (subestructura) del nuevo inhibidor desarrollado para una diana biológica. Se ha informado que varios medicamentos (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) comenzaron como fragmentos y ahora se usan con éxito en las clínicas. Típicamente, los fragmentos son moléculas orgánicas de bajo peso molecular (<250 Da) con una alta solubilidad acuosa y estabilidad. Una biblioteca de fragmentos cuidadosamente elaborada que contiene típicamente unos pocos cientos de fragmentos, ya puede prometer una exploración eficiente del espacio químico. La composición general de las bibliotecas de fragmentos ha evolucionado con el tiempo y la mayoría de las veces se derivaron diseccionando medicamentos conocidos en fragmentos más pequeños o diseñados computacionalmente. Estas diversas bibliotecas de fragmentos contienen principalmente aromáticos planos o heteroátomos y se adhieren a la Regla de Lipinski de 5 6, o a la Regla de tendencia comercial actual de 3 7, pero evitan los grupos reactivos. Algunas bibliotecas de fragmentos también fueron derivadas o compuestas de metabolitos altamente solubles, productos naturales y/o sus derivados8. Un desafío general planteado por la mayoría de las bibliotecas de fragmentos es la facilidad de la química posterior.
El Centro de Resonancia Magnética Biomolecular (BMRZ) de la Universidad Goethe de Frankfurt, es socio del iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), un consorcio de infraestructuras de investigación estructural para todos los investigadores europeos de todos los campos de la investigación bioquímica y biomédica. Dentro de la iniciativa anterior de iNEXT que finalizó en 2019, se creó una biblioteca de fragmentos compuesta por 768 fragmentos con el objetivo de “fragmentos mínimos y máxima diversidad” que cubren un gran espacio químico. Además, a diferencia de cualquier otra biblioteca de fragmentos, la biblioteca de fragmentos iNEXT también se diseñó en base al concepto de “fragmentos preparados” con el objetivo de facilitar la síntesis posterior de ligandos complejos de alta afinidad y, en adelante, conocida como biblioteca interna (Diamond, Structural Genomic Consortium e iNEXT).
El establecimiento de FBDD por RMN requiere mano de obra, conocimiento e instrumentación. En el BMRZ, se han desarrollado flujos de trabajo optimizados para apoyar la asistencia técnica para el cribado de fragmentos por RMN. Estos incluyen control de calidad y evaluación de solubilidad de la biblioteca de fragmentos 9, optimización del tampón para los objetivos elegidos, cribado basado en ligandos 1D observados en 1H o 19F, experimentos de competencia para diferenciar entre unión ortostérica y alostérica, experimentos de RMN observados en 2D para el mapeo de epítopos y para caracterizar la interacción con el conjunto secundario de derivados de los impactos iniciales del fragmento. BMRZ ha establecido rutinas automatizadas para el análisis, como también se discutió anteriormente en la literatura 10,11, de las interacciones molécula-proteína pequeña y cuenta con toda la infraestructura automatizada necesaria para el cribado de fragmentos basado en RMN. Ha implementado la diferencia de transferencia de saturación RMN (STD-NMR), ligando de agua observado a través de espectroscopia de gradiente (waterLOGSY) y experimentos de relajación basados en Carr-Purcell-Meiboom-Gill (basados en CPMG) para identificar fragmentos dentro de una amplia gama de regímenes de afinidad, así como instrumentación y software de RMN automatizados de última generación para el descubrimiento de fármacos. Si bien la detección de fragmentos basada en RMN está bien establecida para las proteínas, este enfoque se usa con menos frecuencia para encontrar nuevos ligandos que interactúan con el ARN y el ADN. BMRZ ha establecido una prueba de concepto para nuevos protocolos que permiten la identificación de interacciones molécula-ARN/ADN pequeñas. En las siguientes secciones de esta contribución, se informa de la aplicación de rutinas de cribado en muestras de proteínas y ARN para dar a conocer los protocolos establecidos para una amplia base de usuarios en la investigación biomacromolecular.
Versatilidad del cribado de fragmentos/fármacos basado en RMN. BMRZ ha implementado con éxito instrumentación automatizada de RMN de última generación, así como STD-RMN, waterLOGSY y experimentos de relajación para identificar fragmentos dentro de una amplia gama de regímenes de afinidad para el descubrimiento de fármacos. El hardware instalado incluye un robot de preparación de muestras de alto rendimiento y un almacenamiento de muestras de alto rendimiento, cambiador y unidad de adquisición de datos asociada a un espectrómetro de 600 MHz. Una sonda criogénica recientemente adquirida para 1 H, 19 F, 13C y 15N garantiza la sensibilidad requerida para las mediciones propuestas y permite un desacoplamiento de 1 H (1) durante la detección de 19F. Esta sonda está conectada a la última generación de consola de RMN que ofrece la posibilidad de utilizar las herramientas de software avanzadas de Bruker, incluyendo CMC-q, CMC-assist, CMC-se y FBS (incluidas en TopSpin). La herramienta de detección basada en fragmentos (FBS) se incluye en la última versión de TopSpin y ayuda a analizar los datos de alto rendimiento que comprenden experimentos de STD, waterLOGSY, T2 / T1 r-relajación. La recolección de muestras líquidas 1D 1H se puede llenar en los tubos de RMN de manera automatizada utilizando el robot de llenado de muestras. Por lo general, un bloque de 96 tubos (3 mm) se llena en aproximadamente dos horas. Los bastidores de placas de 96 pocillos se colocan directamente en el cambiador de muestras HT, que lee el código de barras del bloque y asigna los tubos de RMN a los experimentos controlados por el software de automatización (IconNMR). Se pueden almacenar y programar cinco bastidores de placas de 96 pocillos en el cambiador de muestras HT al mismo tiempo. La temperatura de cada uno de los bastidores individuales se puede controlar y regular por separado. Además, cada muestra individual se puede preacondicionar (precalentamiento y secado en tubo para eliminar la humedad condensada) a la temperatura deseada antes de la medición.
Idoneidad para una amplia gama de aplicaciones. Una de las amplias aplicaciones de este cribado automatizado basado en RMN es identificar y desarrollar nuevos ligandos que se unen a un objetivo biomacromolecular (ADN / ARN / proteínas). Estos ligandos pueden incluir inhibidores ortostéricos y alostéricos que típicamente se unen de forma no covalente. Además, FBDD por RMN se utiliza típicamente como un primer paso para seleccionar compuestos prometedores, los requisitos que deben cumplirse son la disponibilidad del objetivo biomolecular en cantidades suficientes. Este objetivo se divide en dos tareas principales.
La primera tarea es desarrollar y caracterizar una biblioteca de fragmentos interna por las siguientes razones: control de calidad inicial y periódico, caracterización y cuantificación de más de 1000 fragmentos; determinación de la solubilidad de los fragmentos en tampones optimizados para cada diana, en particular para las dianas proteicas; y el establecimiento de varias bibliotecas para dar cabida a diversos andamios y extenderse hacia otras clases de macromoléculas. La segunda tarea es integrar flujos de trabajo para el diseño de fármacos basados en fragmentos (FBDD) mediante RMN utilizando: cribado automatizado observado con ligando 1D (1H y 19F observados); ensayos de reemplazo automatizados (experimentos de competencia con ligando (natural)) para diferenciar la unión ortostérica y alostérica; proyecciones secundarias automatizadas con múltiples fragmentos; cribado automatizado de proteínas 2D y cribado secundario de un conjunto de derivados en torno a un golpe inicial haciendo uso de la biblioteca EU-OPENSCREEN o cualquier otra biblioteca; y volver a perfilar la selección de la biblioteca de la FDA en comparación con los objetivos elegidos.
Además, se puede realizar el metabotipado de varias líneas celulares (relevantes para la enfermedad) para desentrañar los mecanismos reguladores que vinculan el control del ciclo celular y el metabolismo. Además, existe una caracterización funcional de los elementos de regulación de ARN/ADN/proteínas in vivo e in vitro para la optimización de constructo/dominio (optimización de estabilidad para investigaciones estructurales (tampones, pH, temperatura y cribado de sal), y una extensión del cribado de fragmentos basado en RMN a proteínas de membrana y proteínas intrínsecamente desordenadas, que generalmente son inaccesibles para otras técnicas.
Limitaciones. El uso de bibliotecas de fragmentos de 19F y 1H tiene sus pros y sus contras, pocos de los cuales se mencionarán a continuación. El mayor beneficio de las mediciones de 19F frente a 1H es la velocidad tanto del tiempo de medición real como del análisis posterior, ya que las mezclas contienen casi el doble del número de fragmentos y se deben realizar menos experimentos. El análisis de seguimiento también es más fácil para el cribado de 19F, ya que no hay interferencia de los tampones y, además, ofrece un rango de desplazamiento químico más amplio casi sin superposición de señales para una mezcla de fragmentos diseñada de manera óptima. Los espectros mismos están muy simplificados, por lo general sólo tienen una o dos señales por fragmento, dependiendo del número de átomos de flúor. Por lo tanto, el análisis de estos espectros puede automatizarse, reduciendo nuevamente el tiempo. Esto se produce a costa de la diversidad química, al menos para la biblioteca utilizada en este estudio. Como solo ~ 13% de la biblioteca contiene 19 F, pero naturalmente todos ellos son utilizables en la proyección de 1H, la diversidad de los fragmentos de detección de 19F será menor. Esto podría evitarse utilizando bibliotecas 19F diseñadas específicamente con más fragmentos y mayor diversidad química. Otra desventaja para el cribado 19F es el bajo número de señales por fragmento. Los fragmentos generalmente están compuestos de más de un átomo de hidrógeno. Por lo tanto, los experimentos de cribado observados de 1H pueden basarse en diferentes señales para el mismo fragmento para detectar la unión. Esto da un mayor grado de confianza al identificar los aciertos para el cribado de 1H, mientras que el cribado de 19F debe basarse en una o dos señales dadas por fragmento.
Se ha presentado una descripción detallada de la instrumentación automatizada de detección de fragmentos, el software y los métodos y protocolos de análisis automatizados basados en RMN. El hardware instalado incluye un robot de preparación de muestras de alto rendimiento y una unidad de almacenamiento, cambiador y adquisición de datos de muestras de alto rendimiento asociada a un espectrómetro de 600 MHz. Un cabezal de sonda criogénica recientemente instalado para 1 H, 19 F, 13C y 15 N garantiza la sensibilidad requerida para las mediciones propuestas y permite el desacoplamiento de 1H durante la detección de 19F. Además, la última generación de la consola de RMN ofrece la posibilidad de utilizar software analítico avanzado para ayudar a la adquisición y el análisis sobre la marcha. La tecnología discutida anteriormente, los flujos de trabajo y los protocolos descritos deberían fomentar un éxito notable para los usuarios que buscan FBS por RMN.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo ha sido apoyado por iNEXT-Discovery, proyecto número 871037, financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |