Fragmentbasert screening av NMR er en robust metode for raskt å identifisere små molekylbindemidler til biomakromolekyler (DNA, RNA eller proteiner). Protokoller som beskriver automatiseringsbasert prøvepreparering, NMR-eksperimenter og innsamlingsbetingelser og analysearbeidsflyter presenteres. Teknikken muliggjør optimal utnyttelse av både 1H og 19F NMR-aktive kjerner for deteksjon.
Fragmentbasert screening (FBS) er et godt validert og akseptert begrep innenfor legemiddeloppdagelsesprosessen både i akademia og industri. Den største fordelen med NMR-basert fragmentscreening er dens evne til ikke bare å oppdage bindemidler over 7-8 størrelsesordener av affinitet, men også å overvåke renhet og kjemisk kvalitet av fragmentene og dermed produsere treff av høy kvalitet og minimale falske positive eller falske negativer. En forutsetning innen FBS er å utføre innledende og periodisk kvalitetskontroll av fragmentbiblioteket, bestemme løselighet og kjemisk integritet av fragmentene i relevante buffere, og etablere flere biblioteker for å dekke forskjellige stillaser for å imøtekomme ulike makromolekylmålklasser (proteiner / RNA / DNA). Videre kreves en omfattende NMR-basert screeningprotokolloptimalisering med hensyn til prøvemengder, oppkjøpshastighet og analyse på nivået av biologisk konstruksjon / fragment-rom, i tilstandsrom (buffer, tilsetningsstoffer, ioner, pH og temperatur) og i ligand-rom (ligandanaloger, ligandkonsentrasjon). I det minste i akademia har disse screeningarbeidene hittil blitt utført manuelt på en svært begrenset måte, noe som fører til begrenset tilgjengelighet av screeninginfrastruktur, ikke bare i legemiddelutviklingsprosessen, men også i sammenheng med utvikling av kjemiske sonder. For å møte kravene økonomisk, presenteres avanserte arbeidsflyter. De drar nytte av den nyeste avanserte maskinvaren, som væskeprøvesamlingen kan fylles på en temperaturkontrollert måte i NMR-rørene på en automatisert måte. 1H/19F NMR ligandbaserte spektra samles deretter ved en gitt temperatur. Høykapasitetsprøveveksler (HT-prøveveksler) kan håndtere mer enn 500 prøver i temperaturkontrollerte blokker. Dette sammen med avanserte programvareverktøy fremskynder datainnsamling og analyse. Videre er anvendelse av screeningrutiner på protein- og RNA-prøver beskrevet for å gjøre oppmerksom på de etablerte protokollene for en bred brukerbase i biomakromolekylær forskning.
Fragmentbasert screening er nå en mye brukt metode for å identifisere ganske enkle molekyler med lav molekylvekt (MW <250 Da) som viser svak binding til makromolekylære mål inkludert proteiner, DNA og RNA. Innledende treff fra primære skjermer tjener som grunnlag for å gjennomføre en sekundær skjerm av kommersielt tilgjengelige større analoger av treffene og deretter å utnytte kjemibasert fragmentvekst eller koblingsstrategier. For en vellykket fragmentbasert legemiddeloppdagelsesplattform (FBDD) er det generelt nødvendig med en robust biofysisk metode for å oppdage og karakterisere svake treff, et fragmentbibliotek, et biomolekylært mål og en strategi for oppfølgingskjemi. Fire ofte anvendte biofysiske metoder innen legemiddeloppdagelseskampanjene er termiske skiftanalyser, overflateplasmonresonans (SPR), krystallografi og kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR).
NMR-spektroskopi har vist varierte roller innenfor de ulike stadiene av FBDD. Bortsett fra å sikre kjemisk renhet og løselighet av fragmentene i et fragmentbibliotek oppløst i et optimalisert buffersystem, kan ligandobserverte NMR-eksperimenter oppdage fragmentbinding til et mål med lav affinitet, og de målobserverte NMR-eksperimentene kan avgrense bindingsepitopen til fragmentet, og dermed muliggjøre detaljerte struktur-aktivitetsforholdsstudier. Innen epitopkartlegging kan NMR-baserte kjemiske skiftendringer ikke bare identifisere de ortosteriske bindingsstedene, men også allosteriske steder som kan være kryptiske og bare tilgjengelige i såkalte eksiterte konformasjonstilstander av det biomolekylære målet. Hvis det biomolekylære målet allerede binder en endogen ligand, kan de identifiserte fragmenttreffene enkelt klassifiseres som allosteriske eller ortosteriske ved å utføre NMR-baserte konkurranseeksperimenter. Bestemmelse av dissosiasjonskonstanten (KD) av ligand-målinteraksjonen er et viktig aspekt i FBDD-prosessen. NMR-baserte kjemiske skifttitreringer, enten ligand eller mål observert, kan lett utføres for å bestemme KD. En stor fordel med NMR er at interaksjonsstudiene utføres i løsning og nær fysiologiske forhold. Dermed kan alle konformasjonstilstander for analyse av ligand/fragment-interaksjon med målet undersøkes. Videre er NMR-baserte tilnærminger ikke bare begrenset til screening av godt foldede oppløselige proteiner, men blir også brukt for å imøtekomme større målrom, inkludert DNA, RNA, membranbundne og iboende forstyrrede proteiner1.
Fragmentbiblioteker er en uunnværlig del av FBDD-prosessen. Generelt fungerer fragmenter som de første forløperne som til slutt blir en del (substruktur) av den nye inhibitoren utviklet for et biologisk mål. Flere legemidler (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) har blitt rapportert å ha startet som fragmenter og er nå vellykket brukt i klinikkene. Vanligvis er fragmenter lavmolekylære (<250 Da) organiske molekyler med høy vandig løselighet og stabilitet. Et nøye utformet fragmentbibliotek som inneholder typisk noen hundre fragmenter, kan allerede love effektiv utforskning av kjemisk rom. Den generelle sammensetningen av fragmentbiblioteker har utviklet seg over tid og ble oftest avledet ved å dissekere kjente stoffer i mindre fragmenter eller designet beregningsmessig. Disse forskjellige fragmentbibliotekene inneholder hovedsakelig flate aromatiske eller heteroatomer og holder seg til Lipinski-regelen på 5 6, eller til den nåværende kommersielle trendregelen på 3 7, men unngår reaktive grupper. Noen fragmentbiblioteker ble også avledet eller sammensatt av høyoppløselige metabolitter, naturlige produkter og eller deres derivater8. En generell utfordring med de fleste fragmentbibliotekene er enkel nedstrøms kjemi.
Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) ved Goethe-Universitetet i Frankfurt er partner i iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), et konsortium for strukturell forskningsinfrastruktur for alle europeiske forskere fra alle felt innen biokjemisk og biomedisinsk forskning. Innenfor det forrige initiativet til iNEXT som ble avsluttet i 2019, ble et fragmentbibliotek bestående av 768 fragmenter laget med sikte på “minimumsfragmenter og maksimalt mangfold” som dekker et stort kjemisk rom. Videre, i motsetning til alle andre fragmentbiblioteker, ble iNEXT-fragmentbiblioteket også designet basert på konseptet “klare fragmenter” med sikte på å lette nedstrøms syntese av komplekse, høye affinitetsligander og heretter kjent som internt bibliotek (Diamond, Structural Genomic Consortium og iNEXT).
Etablering av FBDD ved NMR krever arbeidskraft, kunnskap og instrumentering. Ved BMRZ har det blitt utviklet optimaliserte arbeidsflyter for å støtte teknisk assistanse til fragmentscreening av NMR. Disse inkluderer kvalitetskontroll og løselighetsvurdering av fragmentbiblioteket 9, bufferoptimalisering for de valgte målene, 1H eller 19F- observert 1D-ligandbasert screening, konkurranseeksperimenter for å skille mellom ortosterisk og allosterisk binding, 2D-baserte målobserverte NMR-eksperimenter for epitopkartlegging, og for å karakterisere interaksjonen med sekundært sett av derivater av de første fragmenttreffene. BMRZ har etablert automatiserte rutiner for analyse, som også tidligere omtalt i litteraturen 10,11, av småmolekyl-protein-interaksjoner og har på plass all nødvendig automatisert infrastruktur for NMR-basert fragmentscreening. Det har implementert metningsoverføringsforskjell NMR (STD-NMR), vannligand observert via gradientspektroskopi (waterLOGSY) og Carr-Purcell-Meiboom-Gill-baserte (CPMG-baserte) avslapningseksperimenter for å identifisere fragmenter innenfor et bredt spekter av affinitetsregimer, samt toppmoderne automatisert NMR-instrumentering og programvare for narkotikaforskning. Mens NMR-basert fragmentscreening er godt etablert for proteiner, er denne tilnærmingen mindre vanlig brukt for å finne nye ligander som interagerer med RNA og DNA. BMRZ har etablert konseptbevis for nye protokoller som muliggjør identifisering av små molekyl-RNA / DNA-interaksjoner. I de følgende avsnittene av dette bidraget rapporteres anvendelse av screeningrutiner på protein- og RNA-prøver for å gjøre oppmerksom på de etablerte protokollene for en bred brukerbase i biomakromolekylær forskning.
Allsidighet av NMR-basert fragment / narkotika screening. BMRZ har vellykket implementert toppmoderne automatisert NMR-instrumentering samt STD-NMR, waterLOGSY og avslapningseksperimenter for å identifisere fragmenter innenfor et bredt spekter av affinitetsregime for narkotikaforskning. Den installerte maskinvaren inkluderer en prøveprepareringsrobot med høy gjennomstrømning og prøvelagrings-, veksler- og datainnsamlingsenhet med høy gjennomstrømning knyttet til et 600 MHz spektrometer. En nylig kjøpt kryogen sonde for 1 H, 19 F, 13 C og 15N sikrer den nødvendige følsomheten for de foreslåtte målingene og tillater 1 H (1) frakobling under 19F-deteksjon. Denne sonden er koblet til siste generasjon NMR-konsoll som gir mulighet til å bruke de avanserte programvareverktøyene fra Bruker, inkludert CMC-q, CMC-assist, CMC-se og FBS (inkludert i TopSpin). Det fragmentbaserte screeningverktøyet (FBS) er inkludert i den nyeste versjonen av TopSpin og hjelper til med å analysere dataene med høy gjennomstrømning som består av STD, waterLOGSY, T2 / T1 r-avslapningseksperimenter. Den flytende 1D 1H-prøvesamlingen kan fylles inn i NMR-rørene på en automatisert måte ved hjelp av prøvefyllingsroboten. Vanligvis fylles en blokk med 96 rør (3 mm) på omtrent to timer. 96-brønnsplatestativene er direkte plassert i HT-prøveveksleren, som leser strekkoden til blokken og tilordner NMR-rørene til eksperimentene som styres av automatiseringsprogramvaren (IconNMR). Fem 96-brønnsplatestativer kan lagres og programmeres i HT-prøveveksleren samtidig. Temperaturen på hvert av de enkelte stativene kan styres og reguleres separat. I tillegg kan hver enkelt prøve forkondisjoneres (forvarming og tørking av rør for fjerning av kondensert fuktighet) til ønsket temperatur før målingen.
Egnethet for et bredt spekter av applikasjoner. En av de brede anvendelsene av denne automatiserte NMR-baserte screeningen er å identifisere og utvikle nye ligander som binder seg til et biomakromolekylært mål (DNA / RNA / proteiner). Disse ligandene kan inkludere ortosteriske og allosteriske hemmere som vanligvis binder ikke-kovalent. Videre brukes FBDD av NMR vanligvis som et første skritt for å velge lovende forbindelser, kravene som skal oppfylles er tilgjengeligheten av det biomolekylære målet i tilstrekkelige mengder. Dette målet er delt inn i to hovedoppgaver.
Oppgave én er å utvikle og karakterisere et internt fragmentbibliotek av følgende grunner: innledende og periodisk kvalitetskontroll, karakterisering og kvantifisering av mer enn 1000 fragmenter; bestemmelse av løseligheten av fragmentene i buffere optimalisert for hvert mål, spesielt for proteinmål; og etablering av flere biblioteker for å imøtekomme ulike stillaser og utvide mot andre makromolekylklasser. Oppgave to er å integrere arbeidsflyter for fragmentbasert legemiddeldesign (FBDD) ved hjelp av: automatisert 1D-ligand observert screening (1H og 19F observert); automatiserte erstatningsanalyser (konkurranseeksperimenter med (naturlig) ligand) for å skille ortosterisk og allosterisk binding; automatiserte sekundære screeninger med flere fragmenter; automatisert 2D-proteinscreening og sekundær screening av et sett med derivater rundt et første treff ved bruk av EU-OPENSCREEN-biblioteket eller et annet bibliotek; og re-profilering screening av FDA-biblioteket mot de valgte målene.
I tillegg kan metabotyping av ulike cellelinjer (sykdomsrelevant) utføres for å avdekke reguleringsmekanismene som knytter cellesykluskontroll og metabolisme. Det er også funksjonell karakterisering av RNA / DNA / proteinreguleringselementer in vivo og in vitro for optimalisering av konstruksjon / domeneoptimalisering (stabilitetsoptimalisering for strukturelle undersøkelser (buffer, pH, temperatur og saltscreening), og en utvidelse av NMR-basert fragmentscreening til membranproteiner og iboende uordnede proteiner, som generelt er utilgjengelige for andre teknikker.
Begrensninger. Bruk av 19F og 1H fragmentbiblioteker har sine fordeler og ulemper, hvorav få vil bli nevnt i det følgende. Den største fordelen med 19F versus 1H-målinger er hastigheten på både den faktiske måletiden og den påfølgende analysen, da blandingene inneholder nesten dobbelt så mange fragmenter og færre eksperimenter må utføres. Oppfølgingsanalysen er også enklere for 19F-screening, da det ikke er noen forstyrrelser fra buffere og i tillegg tilbyr et bredere kjemisk skiftområde med nesten ingen signaloverlapping for en optimalt designet fragmentblanding. Spektrene selv er sterkt forenklet, vanligvis bare med ett eller to signaler per fragment, avhengig av antall fluoratomer. Analysen av disse spektrene kan derfor automatiseres, noe som igjen reduserer tiden. Dette går på bekostning av det kjemiske mangfoldet, i hvert fall for biblioteket som brukes i denne studien. Siden bare ~ 13% av biblioteket inneholder 19 F, men naturligvis alle er brukbare i 1H-screening, vil mangfoldet av de 19F screeningfragmentene være lavere. Dette kan omgås ved hjelp av spesialdesignede 19F-biblioteker med flere fragmenter og større kjemisk mangfold. En annen ulempe for 19F screening er det lave antallet signaler per fragment. Fragmenter består vanligvis av mer enn ett hydrogenatom. Derfor kan observertescreeningeksperimenter med 1 H stole på forskjellige signaler for det samme fragmentet for å oppdage binding. Dette gir en høyere grad av sikkerhet ved identifisering av treff for 1H-screeningen, mens 19F-screeningen må stole på ett eller to signaler gitt per fragment.
En detaljert redegjørelse for moderne automatisert NMR-basert fragmentscreeninginstrumentering, programvare og analysemetoder og protokoller derav har blitt presentert. Den installerte maskinvaren inkluderer en prøveprepareringsrobot med høy gjennomstrømning og en prøvelagrings-, veksler- og datainnsamlingsenhet med høy gjennomstrømning knyttet til et 600 MHz spektrometer. Et nylig installert kryogent sondehode for 1 H, 19 F, 13C og 15 N sikrer den nødvendige følsomheten for de foreslåtte målingene og tillater 1H-frakobling under 19F-deteksjon. Videre tilbyr den nyeste generasjonen av NMR-konsoll muligheten til å bruke avansert analytisk programvare for å hjelpe til med anskaffelse og on-the-fly analyse. Ovennevnte diskutert teknologi, arbeidsflyter og de beskrevne protokollene bør fremme bemerkelsesverdig suksess for brukere som forfølger FBS av NMR.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av iNEXT-Discovery, prosjektnummer 871037, finansiert av EU-kommisjonens Horizon 2020-program.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |