Fragmentgebaseerde screening door NMR is een robuuste methode om snel kleine molecuulbinders voor biomacromoleculen (DNA, RNA of eiwitten) te identificeren. Protocollen die op automatisering gebaseerde monstervoorbereiding, NMR-experimenten en acquisitievoorwaarden en analyseworkflows beschrijven, worden gepresenteerd. De techniek maakt een optimale benutting van zowel 1H als 19F NMR-actieve kernen mogelijk voor detectie.
Fragment-based screening (FBS) is een goed gevalideerd en geaccepteerd concept binnen het proces van geneesmiddelenontdekking, zowel in de academische wereld als in de industrie. Het grootste voordeel van NMR-gebaseerde fragmentscreening is het vermogen om niet alleen bindmiddelen van meer dan 7-8 ordes van grootte van affiniteit te detecteren, maar ook om de zuiverheid en chemische kwaliteit van de fragmenten te bewaken en zo hits van hoge kwaliteit en minimale valse positieven of valse negatieven te produceren. Een vereiste binnen de FBS is het uitvoeren van initiële en periodieke kwaliteitscontrole van de fragmentbibliotheek, het bepalen van de oplosbaarheid en chemische integriteit van de fragmenten in relevante buffers en het opzetten van meerdere bibliotheken om verschillende steigers te bedekken om verschillende macromolecuuldoelklassen (eiwitten / RNA / DNA) te huisvesten. Verder is een uitgebreide NMR-gebaseerde screeningsprotocoloptimalisatie met betrekking tot monsterhoeveelheden, snelheid van acquisitie en analyse op het niveau van biologische constructie / fragmentruimte, in conditieruimte (buffer, additieven, ionen, pH en temperatuur) en in ligandruimte (ligandanalogen, ligandconcentratie) vereist. Althans in de academische wereld zijn deze screeninginspanningen tot nu toe handmatig en op een zeer beperkte manier uitgevoerd, wat heeft geleid tot een beperkte beschikbaarheid van screeninginfrastructuur, niet alleen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen, maar ook in de context van de ontwikkeling van chemische sondes. Om economisch aan de eisen te voldoen, worden geavanceerde workflows gepresenteerd. Ze maken gebruik van de nieuwste state-of-the-art geavanceerde hardware, waarmee de vloeistofmonsterverzameling op een geconditioneerde manier in de NMR-buizen kan worden gevuld. 1H/19F NMR op ligand gebaseerde spectra worden vervolgens verzameld bij een bepaalde temperatuur. High-throughput sample changer (HT sample changer) kan meer dan 500 samples verwerken in temperatuurgecontroleerde blokken. Dit samen met geavanceerde softwaretools versnelt data-acquisitie en -analyse. Verder wordt de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters beschreven om bewust te worden van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.
Fragmentgebaseerde screening is nu een veelgebruikte methode voor het identificeren van vrij eenvoudige moleculen met een laag molecuulgewicht (MW <250 Da) die een zwakke binding vertonen aan macromoleculaire doelen, waaronder eiwitten, DNA en RNA. Initiële hits van primaire schermen dienen als basis om een secundair scherm van commercieel beschikbare grotere analogen van de hits uit te voeren en vervolgens op chemie gebaseerde fragmentgroei- of koppelingsstrategieën te gebruiken. Voor een succesvol platform voor het ontdekken van fragmenten (FBDD) is in het algemeen een robuuste biofysische methode nodig voor het detecteren en karakteriseren van zwakke treffers, een fragmentbibliotheek, een biomoleculair doelwit en een strategie voor vervolgchemie. Vier veelgebruikte biofysische methoden binnen de campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen zijn thermische verschuivingstests, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), kristallografie en kernspinresonantiespectroscopie (NMR).
NMR-spectroscopie heeft verschillende rollen laten zien binnen de verschillende stadia van de FBDD. Afgezien van het waarborgen van de chemische zuiverheid en oplosbaarheid van de fragmenten in een fragmentbibliotheek opgelost in een geoptimaliseerd buffersysteem, kunnen ligand-geobserveerde NMR-experimenten fragmentbinding aan een doelwit met lage affiniteit detecteren en kunnen de doelgeobserveerde NMR-experimenten de bindende epitoop van het fragment afbakenen, waardoor gedetailleerde structuur-activiteitsrelatiestudies mogelijk worden. Binnen epitoopkartering kunnen op NMR gebaseerde chemische verschuivingsveranderingen niet alleen de orthosterische bindingsplaatsen identificeren, maar ook allosterische plaatsen die mogelijk cryptisch zijn en alleen toegankelijk in zogenaamde aangeslagen conformatietoestanden van het biomoleculaire doelwit. Als het biomoleculaire doelwit al een endogene ligand bindt, kunnen de geïdentificeerde fragmenttreffers gemakkelijk worden geclassificeerd als allosterisch of orthosterisch door NMR-gebaseerde competitie-experimenten uit te voeren. Het bepalen van de dissociatieconstante (KD) van de ligand-target interactie is een belangrijk aspect in het FBDD-proces. NMR-gebaseerde chemische verschuivingstitraties, ligand of doel waargenomen, kunnen gemakkelijk worden uitgevoerd om de KD te bepalen. Een groot voordeel van NMR is dat de interactiestudies worden uitgevoerd in oplossing en in de buurt van fysiologische omstandigheden. Zo kunnen alle conformatietoestanden voor de analyse van ligand/fragmentinteractie met zijn doelwit worden onderzocht. Verder zijn NMR-gebaseerde benaderingen niet alleen beperkt tot screening van goed gevouwen oplosbare eiwitten, maar worden ze ook toegepast om grotere doelruimte te accommoderen, waaronder DNA, RNA, membraangebonden en intrinsiek ongeordende eiwitten1.
Fragmentbibliotheken zijn een onmisbaar onderdeel van het FBDD-proces. Over het algemeen fungeren fragmenten als de eerste voorlopers die uiteindelijk deel gaan uitmaken (onderbouw) van de nieuwe remmer die is ontwikkeld voor een biologisch doelwit. Van verschillende geneesmiddelen (Venetoclax2, Vemurafenib3, Erdafitinib4, Pexidartnib5) is gemeld dat ze als fragmenten zijn begonnen en nu met succes in de klinieken worden gebruikt. Typisch, fragmenten zijn lage molecuulgewicht (<250 Da) organische moleculen met een hoge waterige oplosbaarheid en stabiliteit. Een zorgvuldig samengestelde fragmentenbibliotheek met meestal een paar honderd fragmenten, kan al een efficiënte verkenning van de chemische ruimte beloven. De algemene samenstelling van fragmentbibliotheken is in de loop van de tijd geëvolueerd en werd meestal afgeleid door bekende medicijnen in kleinere fragmenten te ontleden of computationeel te ontwerpen. Deze diverse fragmentbibliotheken bevatten voornamelijk platte aromatische of heteroatomen en houden zich aan de Lipinski-regel van 5 6, of aan de huidige commerciële trendregel van 3 7, maar vermijden reactieve groepen. Sommige fragmentbibliotheken waren ook afgeleid van of samengesteld uit sterk oplosbare metabolieten, natuurlijke producten en of derivaten daarvan8. Een algemene uitdaging van de meeste fragmentbibliotheken is het gemak van downstream-chemie.
Het Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ) aan de Goethe-Universiteit Frankfurt is partner van de iNEXT-Discovery (Infrastructure for NMR, EM and X-rays for Translational research-Discovery), een consortium voor structurele onderzoeksinfrastructuren voor alle Europese onderzoekers uit alle domeinen van biochemisch en biomedisch onderzoek. Binnen het vorige initiatief van iNEXT dat in 2019 eindigde, werd een fragmentenbibliotheek bestaande uit 768 fragmenten gemaakt met als doel “minimale fragmenten en maximale diversiteit” die een grote chemische ruimte beslaan. Verder is de iNEXT-fragmentbibliotheek, in tegenstelling tot elke andere fragmentbibliotheek, ook ontworpen op basis van het concept van “gepokte fragmenten” met als doel de downstream-synthese van complexe liganden met hoge affiniteit te vergemakkelijken en voortaan bekend te staan als in-house bibliotheek (Diamond, Structural Genomic Consortium en iNEXT).
Het opzetten van FBDD door NMR vereist mankracht, kennis en instrumentatie. Bij de BMRZ zijn geoptimaliseerde workflows ontwikkeld ter ondersteuning van technische assistentie bij fragmentscreening door NMR. Deze omvatten kwaliteitscontrole en oplosbaarheidsbeoordeling van de fragmentbibliotheek 9, bufferoptimalisatie voor de gekozen doelen, 1H of 19F- waargenomen 1D-ligandgebaseerde screening, competitie-experimenten om onderscheid te maken tussen orthosterische en allosterische binding, 2D-gebaseerde doelgeobserveerde NMR-experimenten voor epitoopkartering en voor het karakteriseren van de interactie met secundaire set derivaten van de initiële fragmenttreffers. BMRZ heeft geautomatiseerde routines opgezet voor de analyse, zoals ook eerder besproken in de literatuur 10,11, van kleine molecuul-eiwitinteracties en heeft alle benodigde geautomatiseerde infrastructuur voor NMR-gebaseerde fragmentscreening. Het heeft verzadigingsoverdrachtsverschil NMR (STD-NMR), waterligand waargenomen via gradiëntspectroscopie (waterLOGSY) en Carr-Purcell-Meiboom-Gill-gebaseerde (CPMG-gebaseerde) relaxatie-experimenten geïmplementeerd om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes, evenals state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie en software voor het ontdekken van geneesmiddelen. Hoewel NMR-gebaseerde fragmentscreening goed ingeburgerd is voor eiwitten, wordt deze aanpak minder vaak gebruikt voor het vinden van nieuwe liganden die interageren met RNA en DNA. BMRZ heeft een proof of concept opgesteld voor nieuwe protocollen die de identificatie van kleine molecuul-RNA / DNA-interacties mogelijk maken. In de volgende secties van deze bijdrage wordt gerapporteerd dat de toepassing van screeningsroutines op eiwit- en RNA-monsters zich bewust maakt van de gevestigde protocollen voor een brede gebruikersbasis in biomacromoleculair onderzoek.
Veelzijdigheid van de NMR-gebaseerde fragment/drug screening. BMRZ heeft met succes state-of-the-art geautomatiseerde NMR-instrumentatie geïmplementeerd, evenals STD-NMR, waterLOGSY en ontspanningsexperimenten om fragmenten te identificeren binnen een breed scala aan affiniteitsregimes voor het ontdekken van geneesmiddelen. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent aangeschafte cryogene sonde voor 1 H, 19 F, 13C en 15N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen en maakt 1H (1) ontkoppeling mogelijk tijdens 19F detectie. Deze sonde is aangesloten op de nieuwste generatie NMR-console die de mogelijkheid biedt om de geavanceerde softwaretools van Bruker te gebruiken, waaronder CMC-q, CMC-assist, CMC-se en FBS (inbegrepen in TopSpin). De fragment-based screening (FBS) tool is opgenomen in de nieuwste versie van TopSpin en helpt bij het analyseren van de high-throughput data bestaande uit STD, waterLOGSY, T2/T1r-relaxatie experimenten. De vloeibare 1D 1H monsterverzameling kan op geautomatiseerde wijze in de NMR-buizen worden gevuld met behulp van de monstervulrobot. Meestal wordt een blok van 96 buizen (3 mm) in ongeveer twee uur gevuld. De 96-well-plate-racks zijn direct geplaatst in de HT-monsterwisselaar, die de barcode van het blok leest en de NMR-buizen toewijst aan de experimenten die worden bestuurd door de automatiseringssoftware (IconNMR). Vijf 96-well-plate-racks kunnen tegelijkertijd in de HT-monsterwisselaar worden opgeslagen en geprogrammeerd. De temperatuur van elk van de afzonderlijke racks kan afzonderlijk worden geregeld en geregeld. Bovendien kan elk afzonderlijk monster vóór de meting worden voorgeconditioneerd (voorverwarmen en buisdrogen voor het verwijderen van gecondenseerde vochtigheid) tot de gewenste temperatuur.
Geschikt voor een breed scala aan toepassingen. Een van de brede toepassingen van deze geautomatiseerde NMR-gebaseerde screening is het identificeren en ontwikkelen van nieuwe liganden die binden aan een biomacromoleculair doelwit (DNA/RNA/Eiwitten). Deze liganden kunnen orthosterische en allosterische remmers bevatten die meestal niet-covalent binden. Verder wordt FBDD door NMR meestal gebruikt als een eerste stap om veelbelovende verbindingen te selecteren, de vereisten waaraan moet worden voldaan, zijn beschikbaarheid van het biomoleculaire doelwit in voldoende hoeveelheden. Deze doelstelling is verdeeld in twee grote taken.
Taak één is het ontwikkelen en karakteriseren van een interne fragmentenbibliotheek om de volgende redenen: initiële en periodieke kwaliteitscontrole, karakterisering en kwantificering van meer dan 1000 fragmenten; bepaling van de oplosbaarheid van de fragmenten in buffers die voor elk doelwit zijn geoptimaliseerd, met name voor eiwitdoelen; en de oprichting van verschillende bibliotheken om verschillende steigers te huisvesten en uit te breiden naar andere macromolecuulklassen. Taak twee is het integreren van workflows voor fragment-based drug design (FBDD) door NMR met behulp van: geautomatiseerde 1D-ligand geobserveerde screening (1H en 19F waargenomen); geautomatiseerde vervangingstesten (competitie-experimenten met (natuurlijk) ligand) om orthosterische en allosterische binding te onderscheiden; geautomatiseerde secundaire screenings met meerdere fragmenten; geautomatiseerde 2D-eiwitscreening en secundaire screening van een reeks derivaten rond een eerste treffer waarbij gebruik wordt gemaakt van de EU-OPENSCREEN-bibliotheek of een andere bibliotheek; en herprofilering screening van FDA-bibliotheek tegen de gekozen doelen.
Bovendien kan metabotypering van verschillende cellijnen (ziekterelevant) worden uitgevoerd om de regulerende mechanismen te ontrafelen die de controle van de celcyclus en het metabolisme met elkaar verbinden. Ook is er functionele karakterisering van RNA / DNA / eiwitregulatie-elementen in vivo en in vitro voor optimalisatie van construct / domeinoptimalisatie (stabiliteitsoptimalisatie voor structureel onderzoek (buffer-, pH-, temperatuur- en zoutscreening), en een uitbreiding van NMR-gebaseerde fragmentscreening naar membraaneiwitten en intrinsiek ongeordende eiwitten, die over het algemeen ontoegankelijk zijn voor andere technieken.
Beperkingen. Het gebruik van 19F- en 1H-fragmentenbibliotheken heeft zijn voor- en nadelen, waarvan er enkele in het volgende zullen worden genoemd. Het grootste voordeel van 19F versus 1H-metingen is de snelheid van zowel de werkelijke meettijd als de daaropvolgende analyse, omdat de mengsels bijna het dubbele aantal fragmenten bevatten en er minder experimenten hoeven te worden uitgevoerd. De vervolganalyse is ook eenvoudiger voor 19F-screening, omdat er geen interferentie van buffers is en bovendien een breder chemisch verschuivingsbereik biedt met bijna geen signaaloverlapping voor een optimaal ontworpen fragmentmengsel. De spectra zelf zijn sterk vereenvoudigd en hebben meestal slechts één of twee signalen per fragment, afhankelijk van het aantal fluoratomen. De analyse van deze spectra kan daarom worden geautomatiseerd, waardoor de tijd opnieuw wordt verkort. Dit gaat ten koste van de chemische diversiteit, althans voor de bibliotheek die in deze studie wordt gebruikt. Omdat slechts ~ 13% van de bibliotheek 19 F bevat, maar ze natuurlijk allemaal bruikbaar zijn in 1H-screening, zal de diversiteit van de 19F-screeningsfragmenten lager zijn. Dit kan worden omzeild met behulp van speciaal ontworpen 19F-bibliotheken met meer fragmenten en een grotere chemische diversiteit. Een ander nadeel voor 19F-screening is het lage aantal signalen per fragment. Fragmenten bestaan over het algemeen uit meer dan één waterstofatoom. Daarom kunnen 1H geobserveerde screeningsexperimenten vertrouwen op verschillende signalen voor hetzelfde fragment voor het detecteren van binding. Dit geeft een hogere mate van vertrouwen bij het identificeren van treffers voor de 1H-screening, terwijl de 19F-screening moet vertrouwen op de één of twee signalen die per fragment worden gegeven.
Een gedetailleerd verslag over de moderne geautomatiseerde NMR-gebaseerde fragmentscreening-instrumentatie, software en analysemethoden en protocollen daarvan is gepresenteerd. De geïnstalleerde hardware omvat een high-throughput monstervoorbereidingsrobot en een high-throughput monsteropslag, wisselaar en data-acquisitie-eenheid gekoppeld aan een 600 MHz spectrometer. Een recent geïnstalleerde cryogene sondekop voor 1 H, 19 F, 13C en 15N zorgt voor de vereiste gevoeligheid voor de voorgestelde metingen en maakt 1H ontkoppeling mogelijk tijdens 19F detectie. Verder biedt de nieuwste generatie NMR-console de mogelijkheid om geavanceerde analytische software te gebruiken voor het ondersteunen van acquisitie en on-the-fly analyse. De hierboven besproken technologie, workflows en de beschreven protocollen zouden opmerkelijk succes moeten bevorderen voor gebruikers die FBS door NMR nastreven.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk is ondersteund door iNEXT-Discovery, projectnummer 871037, gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.
Bruker Avance III HD | Bruker | 600 MHz NMR Spectrometer | |
Matrix Clear Polypropylene 2D Barcoded Open-Top Storage Tubes | 3731-11 0.75ML V-BOTTOM TUBE/LATCH RACK | ThermoFisher Scientific | Barcoded Tubes |
Matrix SepraSeal und DuraSeal& | 4463 Cap Mat, SeptraSeal 10/CS | ThermoFisher Scientific | |
SampleJet | Bruker | HT Sample Changer | |
SamplePro Tube | Bruker | Pipetting Robot |