PDX-modeller för metastaser i centrala nervsystemet representerar fenotypiska och molekylära egenskaper hos humana metastaser, vilket gör dem till utmärkta modeller för prekliniska studier. Här beskrivs hur man etablerar PDX-modeller och de inokuleringsvägar som bäst används för prekliniska studier.
Utvecklingen av nya terapier för metastaser i centrala nervsystemet (CNS) har hindrats av bristen på prekliniska modeller som exakt representerar sjukdomen. Patienthärledda xenograftmodeller (PDX) av CNS-metastaser har visat sig bättre representera de fenotypiska och molekylära egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen, samt bättre återspegla heterogeniteten och klondynamiken hos mänskliga patienttumörer jämfört med historiska cellinjemodeller. Det finns flera platser som kan användas för att implantera vävnad från patient vid inrättande av prekliniska prövningar, var och en med sina egna fördelar och nackdelar, och var och en lämpad för att studera olika aspekter av den metastatiska kaskaden. Här beskriver protokollet hur man etablerar PDX-modeller och presenterar tre olika tillvägagångssätt för att använda PDX-modeller med CNS-metastaser i prekliniska studier, där man diskuterar var och en av deras tillämpningar och begränsningar. Dessa inkluderar flankimplantation, ortotopisk injektion i hjärnan och intrakardiell injektion. Subkutan flankimplantation är lättast att övervaka och därför mest lämplig för prekliniska studier. Dessutom observerades metastaser till hjärnan och andra vävnader från flankimplantation, vilket indikerar att tumören har genomgått flera steg av metastaser, inklusive intravasering, extravasering och kolonisering. Ortotopisk injektion i hjärnan är det bästa alternativet för att rekapitulera hjärntumörmikromiljön och är användbar för att bestämma effekten av biologiska läkemedel för att korsa blod-hjärnbarriären (BBB) men kringgår de flesta stegen i metastaseringskaskaden. Intrakardiell injektion underlättar metastaser till hjärnan och är också användbar för att studera organtropism. Medan denna metod avstår från tidigare steg i den metastatiska kaskaden, måste dessa celler fortfarande överleva cirkulationen, extravasera och kolonisera. Nyttan av en PDX-modell påverkas därför av vägen för tumörinokulering och valet av vilken som ska användas bör dikteras av den vetenskapliga frågan och experimentets övergripande mål.
Incidensen av metastaser till centrala nervsystemet (CNS) har ökat de senaste åren 1,2,3. Traditionella terapier för CNS-metastaser, såsom tumörresektion, strålbehandling av hela hjärnan och stereotaktisk strålkirurgi, har till stor del varit palliativa och sällan botande och kan leda till försvagande biverkningar, såsom kognitiv försämring1. Nyligen utvecklas många nya riktade och immunologiska terapier för behandling av CNS-metastaser som visar löfte om att vara effektivare behandlingar, samtidigt som de har färre biverkningar4.
Att översätta prekliniska resultat till meningsfulla kliniska effektmått kräver ofta effektiva och prediktiva modelleringsstrategier. Historiskt sett var cellinjexenograftmodeller standarden för preklinisk forskning inom CNS-metastasforskning. Dessa cellinjemodeller återspeglar emellertid inte värdtumörens sanna tumörbeteende eller representerar sjukdomens histologiska eller molekylära heterogenitet. Dessutom kan cellinjemodeller anpassa sig till tillväxtförhållanden in vitro och förlorar därför värdtumörens ursprungliga egenskaper. Patienthärledda xenotransplantat (PDX), som transplanterar en patients tumör i en immunbristfällig eller humaniserad mus, används alltmer i translationell cancerforskning. Forskare har visat att PDX-modeller vanligtvis troget kan rekapitulera tumörtillväxt, histologiska egenskaper, upprätthålla tumörheterogenitet, metastatisk potential och molekylärgenetiska egenskaper. Dessutom är PDX-modeller prognostiska där PDX-tumörlatensperioden korrelerar med patientens totala överlevnad och de har också visat sig exakt förutsäga terapeutiskt svar i patientstudier 5,6.
Det har skett en uppkomst av CNS-metastaser PDX. För det mesta har dessa utvecklats som representerar tumörer som härrör från ett enda ursprung, såsom icke-småcellig lungcancer (NSCLC)7, bröstcancer8,9 och melanom10,11. På senare tid har en stor och mångsidig samling PDX-modeller utvecklats och karakteriserats, som representerar åtta olika histologiska subtyper12. Det har visats att PDX-modeller för CNS-metastaser liknar deras ursprungliga patienttumör, både histologiskt och molekylärt, och har också visat histologiska unika skillnader och likheter10,12. Dessutom, medan de flesta CNS-metastaser PDX-modeller upprätthåller den klonala heterogeniteten hos humana tumörer, visade vissa bevis på klonal succession12, vilket gör dem också idealiska för att studera resistens mot terapier genom att övervaka klonala förändringar efter behandling.
De protokoll som beskrivs här beskriver metoder för PDX-etablering och olika inokuleringsvägar som används i prekliniska studier av CNS-metastaser (figur 1). Dessa implantationsmetoder varierar i deras förmåga att efterlikna tillväxt och metastaser. Här belyser protokollet applikationerna för varje implantationsväg och visar hur de kan användas för studier av CNS-metastaser.
I det nuvarande manuskriptet har metoder för PDX-etablering och förökning beskrivits. Tre olika inokuleringsmetoder som kan användas för att lägga upp prekliniska studier vid utvärdering av CNS-metastaser har också visats. Metoden för val bör bero på experimentets mål. I vissa fall skulle det vara fördelaktigt att använda mer än en inokuleringsväg. Till exempel ger subkutan flankimplantation ett enkelt tillvägagångssätt för att studera effektiviteten av ett läkemedel på tumörtillväxt och bedöma läkemedlet på sitt mål och det ger också en visuell för tumörstorlek som lätt övervakas och mäts. Men när målet genomförbarhet och antitumör tillväxt egenskaper är etablerade, kan man inrätta en ortotopisk studie för att bedöma effekten av biologiska att korsa BBB och studera dess effekt inom hjärntumör mikromiljö. Överlevnaden bedöms också bättre i ortotopiska och intrakardiella injektionsstudier.
Intrakraniell injektion av hjärnmetastaser PDX-modeller är ofta den prekliniska modellen som valts på grund av närvaron av hjärnans mikromiljö och BBB. Studier har dock visat att hjärnmetastaser har förmågan att modifiera BBB, vilket påverkar molekylernas permeabilitet till tumören16. Dessa förändringar i BBB skulle inte återspeglas av intrakraniellt implanterade tumörer, och på grund av detta kan prekliniska läkemedelsstudier inte helt återspegla svaret hos patienttumörer. Även med denna varning är intrakraniell injektion fortfarande den bästa metoden för att testa permeabiliteten och effekten av läkemedel för att korsa BBB i prekliniska modeller. En annan utmaning med intrakraniella modeller är att de är svåra att övervaka tumörtillväxt och kräver användning av avbildningstekniker. Viral transduktion av PDX med fluorescerande eller bioluminescerande markörer har traditionellt använts men kan vara utmanande att utföra. Emellertid utvecklas flera avbildningstekniker för användning hos möss som inte kräver införande av markörer, vilket kan förbättra övervakningen av dessa ortotopiska hjärntumörer för prekliniska studier. Dessa inkluderar bildtekniker som magnetisk resonanstomografi (MRT) och positronemissionstomografi (PET) avbildning och mikrodatortomografi (mikro-CT). Slutligen kan intrakraniell injektion inte korrekt återspegla mikromiljön för CNS-metastaser utanför hjärnan, såsom vid leptomeningeal metastasering. I detta fall kan injektion i cisterna magna utföras för att mer exakt representera leptomeningeala metastaser17.
Karakterisering av både fenotypiska och molekylära egenskaper hos PDX-modellen är viktig för att välja de bästa modellerna för prekliniska studier. Tumörlatens kan variera från 7-140 dagar och ta priser kan också vara mycket varierande12. Det optimala antalet djur att implantera och tidpunkten för behandlingsstart måste baseras på egenskaperna hos varje PDX-modell och måste bestämmas empiriskt. Vidare är den molekylära profilen för PDX-tumörer också viktig för valet av de mest representativa PDX-modellerna för prekliniska studier. Ju närmare modellen molekylärt representerar donatorvävnaden, desto mer prediktiv för kliniskt svar är det sannolikt. Det är också viktigt att säkerställa att de mål som väljs från humandata finns i de PDX:er som väljs ut för studier och upprätthålls under några generationer, eftersom den klonala successionen är associerad med en annan genomisk profil hos den etablerade dominerande klonen. Mot bakgrund av detta har de fenotypiska och molekylära profilerna för CNS-metastaserna PDX-tumörer karakteriserats i stor utsträckning över flera generationer12.
Trots de många fördelarna med att använda PDX-modeller med CNS-metastaser finns det flera begränsningar relaterade till deras användning. För det första är en alternativ tumörmikromiljö och särskilt brist på immunförsvar väldokumenterade begränsningar av PDX-modeller18. Xenograft av en mänsklig tumör i möss resulterar i att humant stroma ersätts med musstroma med varje efterföljande passage och det mänskliga stroma ersätts i allmänhet helt efter flera passager19. Skillnaderna i tumörmikromiljön resulterar emellertid inte i stora skillnader i molekylprofilen för flankimplanterade PDX-tumörer jämfört med den ursprungliga patienttumören12, vilket tyder på att flankmodeller fortfarande representerar bra experimentella modeller för att studera CNS-metastaser. För det andra resulterar användningen av immunkomprometterade djur i brist på immuncellsinfiltration i tumören och ett allmänt immunsvar från värden, vilket begränsar ett grundläggande sätt på vilket värden försöker bekämpa cancertillväxt12. Medan humaniserade möss inympade med humana immunceller är tillgängliga för att studera interaktionerna mellan specifika immunceller och tumören, finns det fortfarande många frågor och kontroverser om tillvägagångssätt, metoder och tolkning av dessa resultat20.
Medan majoriteten av PDX har visat sig vara genetiskt stabila, har vi och andra visat att i sällsynta fall, även i avsaknad av behandlingar eller andra externa selektiva tryck, kan det finnas förändringar i klonerna av tumörerna, såsom mindre klonövertagande12,14,15. Detta kan resultera i dramatiska förändringar i molekylprofilen, vilket i slutändan skulle göra att tumören inte återspeglar de dominerande klonerna i patienttumören12. Medan PDX som uppvisar klonal succession kan ha användning i prekliniska studier, kan många gener avsedda för målinriktning (t.ex. Her2) gå förlorade med klonal succession. Därför uppmuntras frekvent screening av PDX-modeller för att avgöra om de fortfarande bibehåller molekylprofilen för den önskade klonen.
Sammanfattningsvis representerar PDX-modeller ett utmärkt modellsystem för studier av inte bara CNS-metastaser utan även andra tumörtyper. Utvecklingen av dessa modeller har visat att de till stor del återspeglar fenotypen, molekylprofilen och heterogeniteten hos humana CNS-metastaser 8,9,10,12. De fungerar som effektiva modeller för att studera både CNS-metastasbiologi och fungerar också bra som fysiologiskt relevanta prekliniska modeller, och ersätter överanvända cellinjemodeller som historiskt använts för in vivo-studier av CNS-metastaser. Utan tvekan finns skillnader mellan PDX och donatorpatienttumör12,18. Att veta vad dessa skillnader är är viktigt för korrekt planering och genomförande av prekliniska studier. Slutligen, genom att välja mellan flera inokuleringsvägar, är PDX-modeller mångsidiga i sin användning som möjliggör studier av flera aspekter av sjukdomen. PDX-modeller kommer utan tvekan att spela en viktig roll för att öka vår förståelse av CNS-metastaser och utvecklingen av nya terapier.
The authors have nothing to disclose.
Figur 3A togs från vår tidigare publikation12 och genererades i Dr. Jann Sarkarias laboratorium vid Mayo Clinic.
25G needle | VWR | BD305122 | |
70 µm Cell strainer | VWR | 21008-952 | |
70% ethanol wipes | VWR | 470106-486 | |
Bone wax | MedVet | W31G-RL | |
CIEA NOG mouse | Taconic | NOG-F | |
DMEM | ThermoFisher | 11965092 | |
Ethiqa XR (buprenorphine SR) | MWI | 072117 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
gentleMACS C Tube | Miltenyi | 130-093-237 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi | 130-095-937 | |
Hamilton syringe | Sigma | 20919 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
Ophthalmic ointment | MedVet | PH-PURALUBE-VET | |
PBS/DPBS | ThermoFisher | 14040133 | |
Povidone iodine swabs | VWR | 15648-906 | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
Surgical drill | Stoelting | 58610 | |
Surgical glue | MedVet | VG3 | |
Surgical sutures | MedVet | MMV-661-V | |
Syringe | VWR | 53548-001 | |
Tumor dissociation kit | Miltenyi | 130-095-929 |