提出了一种基于 农杆菌的注射(农用注射)方案,用于将狐尾花叶病毒和甘蔗花叶病毒克隆接种到玉米幼苗中。以这种方式接种会导致病毒感染、病毒诱导的标记基因沉默以及 GFP 的病毒过表达。
基于农杆菌的接种方法广泛用于将病毒载体引入植物组织。本研究详细介绍了在携带病毒载体的农杆菌的分生组织附近注射玉米幼苗的方案。使用用于基因沉默和基因表达的重组狐尾花叶病毒(FoMV)克隆来优化该方法,其用途扩大到包括用于基因表达的重组甘蔗花叶病毒(SCMV)。将感兴趣的基因片段或编码序列插入到修饰的感染性病毒基因组中,该基因组已被克隆到二进制T-DNA质粒载体pCAMBIA1380中。将得到的质粒构建体转化为根瘤藻菌株GV3101。幼年4天的玉米幼苗可以在鞘翅淋巴结附近注射细菌,重悬于MgSO4溶液中。在农杆菌感染期间,携带病毒基因组的T-DNA被转移到玉米细胞中,从而允许转录病毒RNA基因组。随着重组病毒在整个植物中复制和全身扩散,可以在叶子上观察到靶基因沉默引起的病毒症状和表型变化,病灶模拟22(les22)或八氢番茄红素去饱和酶(pds),或者在用紫外光或荧光显微镜照射时可以检测到绿色荧光蛋白(GFP)的表达。为了同时检测病毒并评估插入片段的完整性,从注射植物的叶子中提取RNA,并使用携带插入序列的多克隆位点(MCS)两侧的引物进行RT-PCR。该方案已在几种玉米基因型中得到有效应用,并且可以很容易地扩展到其他病毒载体,从而为在玉米中引入病毒载体提供了一种可访问的工具。
许多植物病毒的传染性克隆已被设计用于病毒诱导的基因沉默(VIGS),基因过表达(VOX),以及最近的病毒基因编辑(VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11.随着新的病毒构建体的开发,还必须考虑用这些修饰的病毒成功感染植物组织的方法。目前在植物中引发病毒感染的方法包括颗粒轰击,体外RNA转录本或DNA克隆的摩擦接种,血管穿刺接种或根瘤菌接种(农业接种)5,12,13,14,15,16,17.这些接种方法中的每一种都有固有的优点和缺点,包括成本,对专用设备的需求以及给定植物病毒系统的可行性。利用浸润或注射含有二元T-DNA构建体的农杆菌菌株以递送重组病毒的方法更可取,因为它们简单且价格低廉。然而,缺乏对玉米(玉米)等单子叶植物的详细农艺接种方法。
1986年发表了最早的关于用于病毒递送的农学接种的报告之一,当时将花椰菜花叶病毒(CaMV)的基因组插入T-DNA构建体中,并且由此产生的携带该结构 的农杆菌 被摩擦接种到萝卜植物上18。此后,还开发了其他农艺方法。例如,在狐尾花叶病毒(FoMV)的情况下, Nicotiana benthamiana 可以用作中间宿主,在叶子中产生病毒颗粒,提供接种源6。使用受感染的边 莲 叶对玉米进行擦拭接种是有效、快速和简单的,但使用中间宿主并不适用于所有玉米感染病毒。例如,甘蔗花叶病毒(SCMV)不能感染 边莲,需要使用替代接种源来获取来自该病毒的载体。1988年,含有玉米条纹病毒(MSV)(一种DNA病毒)的 农杆菌 通过注射(agroinjection)引入玉米幼苗中,证明基于 农杆菌的接种方法对单子叶植物也很有用19。尽管在农业注射方面取得了早期成功,但很少有研究在玉米中利用该技术,这给该方法对RNA病毒和VIGS,VOX和VEdGE载体的适用性留下了悬而未决的问题20,21,22。然而,在单子叶植物物种中广泛使用农业注射是有希望的,因为这种一般方法已用于兰花,水稻和小麦23,24,25,26,27,28。
该方案针对FoMV和 农杆菌 菌株GV3101进行了优化,并且还应用于SCMV载体。FoMV是一种宿主范围广泛的病毒,包括56种单子叶植物和双子叶植物29。FoMV具有6.2千碱基(kb)阳性意义的单链RNA基因组,可编码来自五个开放阅读框(ORFs)的五种不同蛋白质30,31,32,33,34,35。FoMV以前通过将感染性克隆掺入T-DNA质粒骨架上来开发成玉米的VIGS和VOX载体6,36,37。通过在涂层蛋白(CP)的下游添加克隆位点(MCS1 *)来修饰病毒基因组以用于VIGS应用(图1A)36。对于VOX和VEdGE应用,复制CP启动子并添加第二个克隆位点(MCS2)以在ORF 4和CP之间插入感兴趣的序列(图1B)6。包含 MCS1 和 MCS2 且不带插入片段的 FoMV 矢量是 FoMV 空矢量 (FoMV-EV)(图 1)。
SCMV是一种不相关的病毒,已被开发用于玉米中的VOX38。它是Potyviridae家族的成员,其中几个成员已被设计为在Planta39,40,41,42,43,44中表达外来蛋白。SCMV的宿主范围包括玉米,高粱和甘蔗45,46,使其对这些主要作物植物的基因功能研究很有价值36,38。SCMV具有积极的意义,单链RNA基因组长度约为10 kb47,48。为了创建SCMV VOX载体,利用完善的P1 / HCPro连接作为异源序列的插入位点38。该克隆位点之后是编码NIa-Pro蛋白酶切割位点的序列,导致产生独立于SCMV多蛋白的蛋白质(图1C)。
携带这些重组病毒的传染性cDNA的T-DNA质粒已被转化为 农杆菌 菌株GV3101。GV3101是一种诺帕林型菌株,众所周知,它能够将T-DNA转移到单子叶植物,包括玉米26,28,49。此外,以前的农业注射研究也使用了菌株C58或其衍生物GV3101,以及19,20,22,27。
在该方案的开发中使用了三个标记基因:两个用于基因沉默,一个用于基因表达。利用来自玉米基因 病灶模拟 22(les22,GRMZM2G044074)的329碱基对(bp)片段构建沉默载体FoMV-LES22。当 les22 在玉米中被沉默时,沿着叶子的脉管系统出现小而圆形的坏死细胞斑块,这些坏死细胞扩张并聚结成大面积的坏死叶组织50。FoMV-PDS含有来自高粱基因 八氢番茄红素去饱和酶 (pds,LOC110436156,96%序列与玉米 pds,GRMZM2G410515)的313 bp片段,诱导玉米中 pds 的沉默,导致沿着叶子脉管系统的光漂白细胞小条纹随着时间的推移而延长51。绿色荧光蛋白(GFP)的完整编码序列用于证明FoMV(FoMV-GFP)和SCMV(SCMV-GFP)的蛋白表达。叶片中的GFP表达通常在接种后14天(DPI)6中最容易检测到。尽管以前已有研究利用玉米中病毒载体的农用注射,但这些实验仅表明,农用注射可以促进玉米幼苗中感染性克隆的病毒感染,并且不会扩展到为VIGS或VOX应用设计的重组病毒19,20,21,22。这里提出的协议建立在以前的农业注射方法的基础上,特别是Grismley等人19。总体而言,这种农业注射方法与VIGS和VOX载体兼容,不需要专门的设备或替代宿主作为接种源,并且相对于需要生物化学或体外转录的其他常用方法,减少了建立和执行接种所需的总体时间和成本。该协议将促进玉米的功能基因组学研究,应用涉及VIGS,VOX和VEdGE。
农杆菌 是促进植物相关研究中众多分子生物学技术的重要工具。本研究为将FoMV和SCMV病毒载体直接接种到玉米组织中用于VIGS和VOX应用提供了一种农业注射方案。主要目标是增加基于病毒的技术在单子叶植物中研究的便利性和实用性。虽然已经报道了几种病毒的直接玉米农艺接种,但作者并不知道详细的方案,并且在这些研究中没有VIGS和VOX应用的例子19,22。
据报道,并且在制定该协议时得到证实,注射位置是通过农业注射成功启动全身性病毒感染的关键因素19。在植物上持续注入推荐位置被认为是最大的变量,因为玉米幼苗中分生组织的确切位置几乎无法被眼睛检测到。为了尽量减少人际差异,建议将一些玉米幼苗解剖到分生组织,以更好地可视化其位置(图3C)。对于4-7天龄的植物,分生组织相对于鞘翅节点的位置应大致相同。此外,用染色液体进行注射提供了易于观察的演示,表明”接种物”如何填充叶旋涡,并且由于注射部位用染料标记,因此可以证实注射部位的准确性(图3G,H)。分生组织最容易受到农业注射的影响,但将 农杆菌 悬浮液直接注射到该组织中会导致不良的形态学效应(图6)19。具有受损分生组织的植物存活,但由此产生的缺陷是不可取的,因此,应避免直接注射这种组织。
有几个变量可能会影响通过农业注射成功启动全身性病毒感染,因为三个复杂的生物系统(植物,病毒和 农杆菌 菌株)必须协调相互作用。这种复杂的相互作用可能得益于分生区域快速分裂的细胞,使其成为农艺接种的理想地点19。 农杆菌 菌株必须能够感染植物组织的细胞以递送携带病毒基因组的T-DNA,并且植物必须对病毒敏感才能启动病毒复制和全身感染。玉米基因型对病毒(例如,Mo17对FoMV具有抗药性)或 农杆菌 菌株的易感性不同,但大多数测试似乎对FoMV和SCMV均敏感(表1 和 表2)53。例如,自交系FR1064和甜玉米品种Golden Bantam可能特别容易受到GV3101 农杆菌 和基于FoMV的载体的影响。
抽样的叶数和RT-PCR的取样时间对于准确评估病毒感染至关重要。在这里显示的示例中,叶数是通过从第一个圆形叶子(通常称为”拇指叶”)开始向上计数来确定的。一旦叶子被扩展,叶子就被采样,下一片叶子已经开始出现。然而,哪些叶子最适合采样可能因所使用的病毒种类,生长条件和玉米基因型而异。因此,在将此方案应用于新的病毒系统时,建议进行初始时间过程实验,以优化有关叶子和时间的采样策略。
使用的特定结构显着影响该协议的效率。例如,空载体FoMV-EV和SCMV-EV以及FoMV-PDS和FoMV-LES22都含有小插入片段(分别为313 bp和329 bp),通常在这些实验中产生具有病毒症状的植物的最高百分比(表1 和 表2)。然而,与注射空载体或基因沉默构建体的植物相比,在FoMV-GFP和SCMV-GFP中携带较大GFP ORF(720 bp)插入物的重组病毒的感染率要低得多。这种趋势可能是由于病毒基因组中外源性遗传物质数量的增加对病毒适应性造成的负面影响。一些研究表明,植物病毒载体的插入稳定性在很大程度上取决于插入大小和序列36,54,55,56,57。此外,在接种FoMV或SCMV空载体后被感染的植物百分比存在显着差异,这表明需要额外的工作来优化SCMV的该方案(表1)。这些结果表明,在开发构造时可能需要进行一些故障排除,因为片段的顺序和长度都会影响效率。
总体而言,本研究表明,玉米幼苗的农用注射是两种不同RNA植物病毒、多种载体配置和11种玉米基因型的有效接种方法。这项与FoMV和SCMV的工作,结合先前利用玉米绿斑驳病毒(MCMV)或MSV注射的工作,表明农业注射适用于接种具有RNA和DNA病毒感染性克隆的玉米幼苗19,20,21,22。此外,这项工作进一步表明,农业注射是VIGS和VOX载体的可行方法,可以应用于幼年为四天的植物(表3)。预计这里提出的方案将很容易被玉米生物学家采用,以促进涉及瞬时基因沉默(VIGS)和过表达(VOX)的功能基因组学研究的研究。Agroinjection还具有促进基于病毒的基因编辑方法(VEdGE)的能力,否则这些方法将受到依赖植物转化的限制,从而可能提高编辑效率和可访问性58,59,60。鉴于适当的 农杆菌 菌株,玉米基因型和病毒载体经过深思熟虑的组合,通过农业注射接种有望成为玉米瞬时基因功能分析的宝贵工具。
The authors have nothing to disclose.
爱荷华州立大学是支持DARPA昆虫盟友计划HR0011-17-2-0053的团队的一部分。这项工作还得到了爱荷华州立大学植物科学研究所,爱荷华州立大学作物生物工程中心,美国农业部NIFA Hatch项目编号3808和爱荷华州基金的支持。K.L.H.还得到了爱荷华州立大学预测植物表型组学研究生培训计划的部分支持,该计划由美国国家科学基金会(DGE #1545453)资助,并由美国农业部国家食品和农业研究所的农业和食品研究计划拨款编号2019-07318资助。资助者在设计研究、收集、分析和解释数据以及撰写手稿方面没有任何作用。本材料中表达的任何意见、发现、结论或建议均为作者的观点,并不一定反映出资者的观点。
我们感谢Nick Lauter(USDA-ARS,Ames,IA)的玉米自交系种子,Christian F. Montes-Serey(爱荷华州立大学)制作FoMV-GFP克隆,以及Tyler Austin(爱荷华州立大学)的技术援助。
1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
37°C Incubator | For E. coli | ||
Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
Ethanol | For RNA extraction | ||
Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
Fluorescence Microscope | |||
Gel Electrophoresis Box | |||
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
PacI | New England Biolabs | R0547 | |
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
pH Meter | |||
Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
Thermocycler | For PCR | ||
Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
XbaI | New England Biolabs | R0145 |