En Agrobacterium-baseret injektion (agroinjection) protokol præsenteres til podning af foxtail mosaikvirus og sukkerrør mosaik viruscloner i majsplanter. Podning på denne måde fører til virusinfektion, virusinduceret genhæmning af markørgener og viral overekspression af GFP.
Agrobacterium-baserede podningsmetoder anvendes i vid udstrækning til at indføre virale vektorer i plantevæv. Denne undersøgelse beskriver en protokol til injektion af majsplanter nær meristematisk væv med Agrobacterium , der bærer en viral vektor. Rekombinante foxtail mosaikvirus (FoMV) kloner konstrueret til genhæmning og genekspression blev brugt til at optimere denne metode, og dens anvendelse blev udvidet til at omfatte en rekombinant sukkerrør mosaikvirus (SCMV) konstrueret til genekspression. Genfragmenter eller kodende sekvenser af interesse indsættes i et modificeret, infektiøst viralt genom, der er blevet klonet i den binære T-DNA-plasmidvektor pCAMBIA1380. De resulterende plasmidkonstruktioner omdannes til Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101. Majsplanter så unge som 4 dage gamle kan injiceres nær coleoptilar knuden med bakterier resuspended i MgSO4 opløsning. Under infektion med Agrobacterium overføres T-DNA’et, der bærer det virale genom, til majsceller, hvilket muliggør transkription af det virale RNA-genom. Da den rekombinante virus replikerer og systematisk spredes gennem hele planten, kan virale symptomer og fænotypiske ændringer som følge af hæmning af målgenernes læsion efterligne 22 (les22) eller phytoendesaturase (pds) observeres på bladene, eller ekspression af grønt fluorescerende protein (GFP) kan detekteres ved belysning med UV-lys eller fluorescensmikroskopi. For at detektere viruset og vurdere insertets integritet samtidigt ekstraheres RNA fra bladene på den injicerede plante, og RT-PCR udføres ved hjælp af primere, der flankerer det multiple kloningssted (MCS), der bærer den indsatte sekvens. Denne protokol er blevet anvendt effektivt i flere majsgenotyper og kan let udvides til andre virale vektorer og tilbyder derved et tilgængeligt værktøj til introduktion af viral vektor i majs.
Infektiøse kloner af mange plantevira er blevet konstrueret til virusinduceret genhæmning (VIGS), genoverekspression (VOX) og senest virusaktiveret genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Efterhånden som nye virale konstruktioner udvikles, skal metoder til med succes at inficere plantevæv med disse modificerede vira også overvejes. Nuværende metoder til at lancere virusinfektioner i planter omfatter partikelbombardement, rub-podning af in vitro RNA-transkripter eller DNA-kloner, vaskulær punkteringspodning eller Agrobacterium tumefaciens podning (agroinokulation)5,12,13,14,15,16,17 . Hver af disse podningsmetoder har iboende fordele og ulemper, som omfatter omkostninger, behov for specialudstyr og gennemførlighed inden for et givet plantevirussystem. Metoder, der anvender infiltration eller injektion af Agrobacterium-stammer, der indeholder binære T-DNA-konstruktioner designet til at levere rekombinante vira, foretrækkes, fordi de er enkle og billige. Der mangler imidlertid detaljerede agroinokuleringsmetoder for monocotyledonøse arter som Zea mays (majs).
En af de første rapporter om agroinokulering til viruslevering blev offentliggjort i 1986, da genomet af blomkålmosaikvirus (CaMV) blev indsat i en T-DNA-konstruktion, og den resulterende Agrobacterium, der bærer denne konstruktion, blev rub-podet på majroeplanter18. Yderligere metoder til agroinokulering er siden blevet udviklet. I tilfælde af foxtail mosaikvirus (FoMV) kan Nicotiana benthamiana f.eks. bruges som mellemvært til at generere viruspartikler i blade, der giver en inokulumkilde6. Rub podning af majs ved hjælp af inficerede N. benthamiana blade er effektiv, hurtig og enkel, men brugen af en mellemliggende vært virker ikke for alle majsinficerende vira. Sukkerrørmosaikvirus (SCMV) kan for eksempel ikke inficere N. benthamiana, hvilket kræver anvendelse af alternative inokulumkilder til vektorer afledt af denne virus. I 1988 blev Agrobacterium indeholdende majsstribevirus (MSV), en DNA-virus, indført i majsplanter ved injektion (agroinjektion), hvilket demonstrerede, at Agrobacterium-baserede podningsmetoder også er nyttige til monocots19. På trods af denne tidlige succes med agroinjektion er der kun offentliggjort få undersøgelser, der anvender denne teknik i majs, hvilket efterlader åbne spørgsmål om anvendeligheden af denne metode til RNA-vira og VIGS-, VOX- og VEdGE-vektorer20,21,22. Imidlertid er bred anvendelse af agroinjektion i monocot-arter lovende, fordi denne generelle tilgang er blevet brugt i orkidé, ris og hvede23,24,25,26,27,28.
Denne protokol blev optimeret til FoMV og Agrobacterium stamme GV3101 og er også blevet anvendt på en SCMV-vektor. FoMV er et potexvirus med et bredt værtsområde, der omfatter 56 monocot- og dicotarter29. FoMV har et 6,2 kilobase (kb) positivt sans, enkeltstrenget RNA-genom, der koder for fem forskellige proteiner fra fem åbne læserammer (ORF’er)30,31,32,33,34,35. FoMV blev tidligere udviklet til både en VIGS- og VOX-vektor til majs ved at inkorporere en infektiøs klon på en T-DNA-plasmidrygrad6,36,37. Det virale genom blev modificeret til VIGS-applikationer ved at tilføje et kloningssted (MCS1*) umiddelbart nedstrøms for pelsproteinet (CP) (figur 1A)36. For VOX- og VEdGE-applikationer blev CP-promotoren duplikeret, og et andet kloningssted (MCS2) blev tilføjet for at muliggøre indsættelse af sekvenser af interesse mellem ORF 4 og CP (figur 1B)6. FoMV-vektoren, der indeholder både MCS1 og MCS2 uden skær, er FoMV tom vektor (FoMV-EV) (figur 1).
SCMV er en ikke-relateret virus, der er udviklet til VOX i majs38. Det er medlem af Potyviridae-familien, hvoraf flere medlemmer er blevet konstrueret til at udtrykke fremmede proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Værtsområdet for SCMV omfatter majs, sorghum og sukkerrør45,46, hvilket gør det værdifuldt for genfunktionelle undersøgelser i disse store afgrødeplanter36,38. SCMV har et positivt sense, enkeltstrenget RNA-genom på ca. 10 kb i længden47,48. For at skabe SCMV VOX-vektoren blev det veletablerede P1/HCPro-kryds brugt som indsættelsessted for heterologe sekvenser38. Dette kloningssted efterfølges af sekvens, der koder for et NIa-Pro proteasespaltningssted, hvilket fører til produktion af proteiner, der er uafhængige af SCMV-polyproteinet (figur 1C).
T-DNA-plasmider, der bærer infektiøst cDNA af disse rekombinante vira, er blevet omdannet til Agrobacterium-stamme GV3101. GV3101 er en nopalin type stamme, som er velkendt for at kunne overføre T-DNA til monocotyledonous arter, herunder majs26,28,49. Derudover har tidligere agroinjektionsundersøgelser brugt stammerne C58 eller dets derivat GV3101 samt19,20,22,27.
Tre markørgener blev anvendt i udviklingen af denne protokol: to til genhæmning og en til genekspression. Et 329 basepar (bp) fragment fra majsgenlæsionen efterligner 22 (les22, GRMZM2G044074) blev brugt til at konstruere dæmpningsvektoren FoMV-LES22. Når les22 er tavs i majs, vises små, runde pletter af nekrotiske celler langs vaskulaturen af blade, der udvider sig og samler sig i store områder af nekrotisk bladvæv50. FoMV-PDS, der indeholder et 313 bp fragment fra sorghumgenet phytoen desaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvensidentitet til majs pds, GRMZM2G410515), inducerer dæmpning af pds i majs, hvilket resulterer i små striber af fotoblegede celler langs vaskulaturen af bladene, der forlænges over tid51. Den intakte kodningssekvens for grønt fluorescerende protein (GFP) blev brugt til at demonstrere proteinekspression for både FoMV (FoMV-GFP) og SCMV (SCMV-GFP). GFP-ekspression i bladene er typisk mest påviselig 14 dage efter podning (DPI)6. Selvom der har været tidligere undersøgelser, der anvender agroinjektion af virale vektorer i majs, har disse eksperimenter kun vist, at agroinjektion kan lette virusinfektion fra en infektiøs klon i majsplanter og ikke udvides til rekombinante vira designet til VIGS- eller VOX-applikationer19,20,21,22. Protokollen, der præsenteres her, bygger på tidligere agroinjektionsmetoder, især Grismley et al.19. Samlet set er denne agroinjektionsmetode kompatibel med VIGS- og VOX-vektorer, kræver ikke specialudstyr eller alternative værter som inokulumkilder og reducerer den samlede tid og de omkostninger, der kræves for at oprette og udføre podninger i forhold til andre almindelige metoder, der kræver bioletik eller in vitro-transkription. Denne protokol vil lette funktionelle genomforskninger i majs med applikationer, der involverer VIGS, VOX og VEdGE.
Agrobacterium er et vigtigt værktøj, der letter adskillige molekylærbiologiske teknikker i planterelateret forskning. Denne undersøgelse giver en agroinjektionsprotokol til inokulering af FoMV- og SCMV-virale vektorer direkte i majsvæv til VIGS- og VOX-applikationer. Hovedmålet er at øge letheden og nytten af virusbaserede teknologier til forskning i monocot afgrødeplanter. Selv om der er rapporteret om direkte agroinokulering af majs for nogle få vira, er forfatterne ikke bekendt med en detaljeret protokol, og der er ingen eksempler på VIGS- og VOX-applikationer i disse undersøgelser19,22.
Det er blevet rapporteret og blev bekræftet under udviklingen af denne protokol, at injektionsstedet er en nøglefaktor for en vellykket lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion19. Konsekvent injektion af den anbefalede placering på planten antages at være den største variabel, fordi meristemets nøjagtige position i majsplanter næsten ikke kan detekteres af øjet. For at minimere interpersonel variation anbefales det at dissekere et par majsplanter ned til meristemet for bedre at visualisere dets placering (figur 3C). Meristemets position i forhold til coleoptilar knuden skal være nogenlunde den samme for planter i alderen 4-7 dage gamle. Derudover giver praktisering af injektion med en farvet væske en let synlig demonstration af, hvordan “inokulumet” fylder bladhvirvelen, og fordi injektionsstedet er markeret med farvestof, kan nøjagtigheden af injektionsstedet bekræftes (figur 3G,H). Meristematisk væv er de mest modtagelige for agroinjektion, men injektion af Agrobacterium-suspensioner direkte i dette væv resulterer i uønskede morfologiske virkninger (figur 6)19. Planter med beskadigede meristemer overlever, men de resulterende defekter er uønskede, og derfor bør direkte injektion af dette væv undgås.
Der er flere variabler, der kan påvirke den vellykkede lancering af en systemisk virusinfektion via agroinjektion, fordi tre komplekse biologiske systemer (plante-, virus- og Agrobacterium-stamme) skal interagere i koordination. Dette komplekse samspil kan hjælpes på hjælp af de hurtigt delende celler i det meristematiske område, hvilket gør det til et ideelt sted for agroinokulering19. Agrobacterium-stammen skal kunne inficere celler i plantevævet for at levere det T-DNA, der bærer det virale genom, og planten skal være modtagelig for virussen for at kunne igangsætte viral replikation og systemisk infektion. Majsgenotyper adskiller sig i deres modtagelighed for vira (f.eks. Mo17 er resistent over for FoMV) eller Agrobacterium-stammer, men de fleste, der blev testet, synes at være modtagelige for både FoMV og SCMV (tabel 1 og tabel 2)53. For eksempel kan den indavlede linje FR1064 og sødmajssorten Golden Bantam være særligt modtagelige for både GV3101 Agrobacterium og FoMV-baserede vektorer.
Bladnummeret og tidspunktet for prøveudtagning for RT-PCR er afgørende for nøjagtig vurdering af virusinfektion. I de eksempler, der er vist her, blev bladtallet bestemt ved at starte ved det første afrundede blad (almindeligvis kendt som “tommelfingerbladet”) og tælle opad. Bladene blev samplet, når de var udvidet, og det næste blad var begyndt at dukke op. Hvilke blade der er optimale til prøveudtagning, kan dog variere afhængigt af de anvendte virusarter, vækstbetingelser og majsgenotype. Derfor anbefales et indledende tidskursuseksperiment, når denne protokol anvendes på et nyt virussystem for at optimere prøveudtagningsstrategien med hensyn til blade og timing.
Den specifikke konstruktion, der anvendes, påvirker effektiviteten af denne protokol betydeligt. For eksempel producerer de tomme vektorer, FoMV-EV og SCMV-EV og FoMV-PDS og FoMV-LES22, som begge indeholder små skær (henholdsvis 313 bp og 329 bp), typisk de højeste procentdele af planter med virale symptomer i disse forsøg (tabel 1 og tabel 2). Rekombinante vira, der bærer større skær af GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP og SCMV-GFP, havde imidlertid meget lavere infektionshastigheder sammenlignet med planter injiceret med de tomme vektor- eller genhæmningskonstruktioner. Denne tendens kan skyldes de negative virkninger på viral fitness forårsaget af stigende mængder eksogent genetisk materiale i det virale genom. Flere undersøgelser har vist, at insertstabiliteten af plantevirale vektorer i høj grad afhænger af insertstørrelse og sekvens36,54,55,56,57. Derudover var der en bemærkelsesværdig forskel i procentdelen af planter, der bliver inficeret efter podning med enten FoMV eller SCMV tom vektor, hvilket tyder på, at der er behov for yderligere arbejde for at optimere denne protokol til SCMV (tabel 1). Disse resultater indikerer, at der kan være behov for en vis fejlfinding, når man udvikler en konstruktion, fordi fragmentets sekvens og længde begge kan påvirke effektiviteten.
Samlet set har denne undersøgelse vist, at agroinjektion af majsplanter er en effektiv podningsmetode til to forskellige RNA-plantevira, flere vektorkonfigurationer og 11 genotyper af majs. Dette arbejde med FoMV og SCMV, parret med tidligere værker, der anvender injektion med majs chlorotic mottle virus (MCMV) eller MSV, indikerer, at agroinjektion er egnet til podning af majsplanter med infektiøse kloner af både RNA- og DNA-vira19,20,21,22. Derudover viser dette arbejde yderligere, at agroinjektion er en levedygtig metode til VIGS- og VOX-vektorer og kan anvendes på planter så unge som fire dage gamle (tabel 3). Den protokol, der præsenteres her, forventes let at blive tilpasset af majsbiologer for at lette forskning i funktionelle genomiske undersøgelser, der involverer forbigående genhæmning (VIGS) og overekspression (VOX). Agroinjektion har også kapacitet til at lette virusbaserede genredigeringsmetoder (VEdGE), der ellers ville være begrænset af afhængighed af plantetransformation, hvilket potentielt forbedrer redigeringseffektiviteten samt tilgængeligheden58,59,60. I betragtning af at den relevante Agrobacterium-stamme, majsgenotyper og virale vektorer er omhyggeligt kombineret, forventes podning ved agroinjektion at blive et værdifuldt redskab til forbigående genfunktionsanalyser i majs.
The authors have nothing to disclose.
Iowa State University er en del af et team, der støtter DARPAs Insect Allies-program HR0011-17-2-0053. Dette arbejde blev også støttet af Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projektnummer 3808 og State of Iowa Funds. KLH blev også delvist støttet af Iowa State University Predictive Plant Phenomics kandidatuddannelsesprogram finansieret af National Science Foundation (DGE #1545453) og af Agricultural and Food Research Initiative tilskud nr. 2019-07318 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiererne havde ingen rolle i udformningen af undersøgelsen og indsamlingen, analysen og fortolkningen af data og i at skrive manuskriptet. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis finansieringskildernes synspunkter.
Vi takker Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) for frø af majs indavlede linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) for at gøre FoMV-GFP klonen og Tyler Austin (Iowa State University) for teknisk bistand.
1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
37°C Incubator | For E. coli | ||
Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
Ethanol | For RNA extraction | ||
Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
Fluorescence Microscope | |||
Gel Electrophoresis Box | |||
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
PacI | New England Biolabs | R0547 | |
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
pH Meter | |||
Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
Thermocycler | For PCR | ||
Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
XbaI | New England Biolabs | R0145 |