En Agrobacterium-basert injeksjonsprotokoll (agroinjection) presenteres for inokulering av foxtail mosaikkvirus og sukkerrør mosaikkvirus i maisplanter. Inokulering på denne måten fører til virusinfeksjon, virusindusert genaktivering av markørgener og viral overekspressering av GFP.
Agrobacterium-baserte inokulasjonsmetoder er mye brukt til å introdusere virale vektorer i plantevev. Denne studien beskriver en protokoll for injeksjon av maisplanter nær meristematisk vev med Agrobacterium som bærer en viral vektor. Rekombinante foxtail mosaikkvirus (FoMV) kloner utviklet for genaktivering og genuttrykk ble brukt til å optimalisere denne metoden, og bruken ble utvidet til å omfatte et rekombinant sukkerrør mosaikkvirus (SCMV) konstruert for genuttrykk. Genfragmenter eller kodesekvenser av interesse settes inn i et modifisert, smittsomt viralt genom som har blitt klonet inn i den binære T-DNA-plasmidvektoren pCAMBIA1380. De resulterende plasmidkonstruksjonene forvandles til Agrobacterium tumefaciens stamme GV3101. Maisplanter så unge som 4 dager gamle kan injiseres nær coleoptilar-noden med bakterier som er resuspendert i MgSO4-løsningen . Under infeksjon med Agrobacterium overføres T-DNA som bærer det virale genomet til maisceller, noe som muliggjør transkripsjon av det virale RNA-genomet. Når det rekombinante viruset replikerer og sprer seg systemisk over hele planten, kan virale symptomer og fenotypiske endringer som følge av silencing av målgenene lesjon etterligne 22 (les22) eller fytoendesaturase (pds) observeres på bladene, eller uttrykk for grønt fluorescerende protein (GFP) kan oppdages ved belysning med UV-lys eller fluorescensmikrokopi. For å oppdage viruset og vurdere integriteten til innsatsen samtidig, blir RNA ekstrahert fra bladene på det injiserte anlegget, og RT-PCR utføres ved hjelp av primere som flankerer flere kloningssted (MCS) som bærer den innsatte sekvensen. Denne protokollen har blitt brukt effektivt i flere mais genotyper og kan lett utvides til andre virale vektorer, og dermed tilby et tilgjengelig verktøy for viral vektor introduksjon i mais.
Infeksiøse kloner av mange plantevirus er utviklet for virusindusert genaktivering (VIGS), genovertrykk (VOX), og senest virusaktivert genredigering (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Etter hvert som nye virale konstruksjoner utvikles, må metoder for å infisere plantevev med disse modifiserte virusene også vurderes. Nåværende metoder for å starte virusinfeksjoner i planter inkluderer partikkelbombardement, gni-inokulering av in vitro RNA-transkripsjoner eller DNA-kloner, vaskulær punktering inokulasjon eller Agrobacterium tumefaciens inokulasjon (agroinokulasjon)5,12,13,14,15,16,17 . Hver av disse inokulasjonsmetodene har iboende fordeler og ulemper, som inkluderer kostnader, behov for spesialisert utstyr og gjennomførbarhet innenfor et gitt plantevirussystem. Metoder som bruker infiltrasjon eller injeksjon av Agrobacterium stammer som inneholder binære T-DNA konstruksjoner designet for å levere rekombinante virus er foretrukket, fordi de er enkle og rimelige. Imidlertid mangler detaljerte agroinokulasjonsmetoder for monokotyledonøse arter som Zea mays (mais).
En av de første rapportene om agroinokulasjon for viruslevering ble publisert i 1986, da genomet av blomkålmosaikkvirus (CaMV) ble satt inn i en T-DNA-konstruksjon, og den resulterende Agrobacterium som bærer denne konstruksjonen ble gnidd inn i rognplanter18. Ytterligere metoder for agroinokulasjon har siden blitt utviklet. For eksempel, når det gjelder foxtail mosaikkvirus (FoMV), kan Nicotiana benthamiana brukes som en mellomliggende vert for å generere viruspartikler i blader som gir en inoculum kilde6. Gni inokulering av mais ved hjelp av infiserte N. benthamiana blader er effektiv, rask og enkel, men bruk av en mellomliggende vert fungerer ikke for alle mais-infiserende virus. Sugarcane mosaikkvirus (SCMV), for eksempel, kan ikke infisere N. benthamiana, som krever bruk av alternative inoculum kilder for vektorer avledet fra dette viruset. I 1988 ble Agrobacterium som inneholder mais stripe virus (MSV), et DNA-virus, introdusert i maisplanter ved injeksjon (agroinjection), som demonstrerer Agrobacterium-baserte inokulasjonsmetoder er også nyttige for monocots19. Til tross for denne tidlige suksessen med agroinjection, har få studier som bruker denne teknikken i mais blitt publisert, og etterlater åpne spørsmål om anvendelsen av denne metoden for RNA-virus og VIGS-, VOX- og VEdGE-vektorer20,21,22. Imidlertid er bred bruk av agroinjeksjon i monocot arter lovende, fordi denne generelle tilnærmingen har blitt brukt i orkidé, ris og hvete23,24,25,26,27,28.
Denne protokollen ble optimalisert for FoMV og Agrobacterium stamme GV3101 og har også blitt brukt på en SCMV vektor. FoMV er et potexvirus med et bredt vertsområde som inkluderer 56 monokot- og dikotarter29. FoMV har en 6,2 kilobase (kb) positiv sans, enkeltstrenget RNA-genom som koder fem forskjellige proteiner fra fem åpne leserammer (ORFer) 30,31,32,33,34,35. FoMV ble tidligere utviklet til både en VIGS- og VOX-vektor for mais ved å inkorporere en smittsom klone på en T-DNA-plasmid ryggrad6,36,37. Det virale genomet ble modifisert for VIGS-applikasjoner ved å legge til et kloningssted (MCS1*) umiddelbart nedstrøms for frakkproteinet (CP) (figur 1A)36. For VOX- og VEdGE-applikasjoner ble CP-promotoren duplisert og et annet kloningssted (MCS2) ble lagt til for å muliggjøre innsetting av sekvenser av interesse mellom ORF 4 og CP (figur 1B)6. FoMV-vektoren som inneholder både MCS1 og MCS2 uten innsatser, er FoMV tom vektor (FoMV-EV) (figur 1).
SCMV er et ikke-relatert virus som er utviklet for VOX i mais38. Det er medlem av Potyviridae-familien, hvorav flere medlemmer er konstruert for å uttrykke fremmede proteiner i planta39,40,41,42,43,44. Vertsutvalget for SCMV inkluderer mais, sorghum og sukkerrør45,46, noe som gjør det verdifullt for genfunksjonelle studier i disse store avlingsplantene36,38. SCMV har en positiv følelse, enkeltstrenget RNA genom på ca 10 kb i lengde47,48. For å lage SCMV VOX-vektoren ble det veletablerte P1/HCPro-krysset brukt som innsettingssted for heteroologe sekvenser38. Dette kloningsstedet etterfølges av sekvenskoding av et NIa-Pro protease spaltingssted, noe som fører til produksjon av proteiner uavhengig av SCMV polyprotein (figur 1C).
T-DNA-plasmider som bærer smittsomme cDNA av disse rekombinante virusene har blitt forvandlet til Agrobacterium stamme GV3101. GV3101 er en nopalin type stamme, som er kjent for å kunne overføre T-DNA til monokotyledonøse arter, inkludert mais26,28,49. I tillegg har tidligere agroinjeksjonsstudier brukt stammene C58 eller dets derivat GV3101, samt19,20,22,27.
Tre markørgener ble brukt i utviklingen av denne protokollen: to for genaktivering og ett for genuttrykk. Et 329 basepar (bp) fragment fra maisgenlesjonen etterligner 22 (les22, GRMZM2G044074) ble brukt til å konstruere silencingvektoren FoMV-LES22. Når les22 er taus i mais, vises små, runde flekker av nekrotiske celler langs vaskulaturen av blader som ekspanderer og samles i store områder av nekrotisk bladvev50. FoMV-PDS, som inneholder et fragment på 313 bp fra sorghum-genet fytoendesaturase (pds, LOC110436156, 96% sekvensidentitet til mais pds, GRMZM2G410515), induserer silencing av pds i mais, noe som resulterer i små striper av fotobleached celler langs vaskulaturen av bladene som forlenger over tid5. Den intakte kodesekvensen for grønt fluorescerende protein (GFP) ble brukt til å demonstrere proteinuttrykk for både FoMV (FoMV-GFP) og SCMV (SCMV-GFP). GFP-uttrykk i bladene er vanligvis mest påviselig ved 14 dager etter inokulasjon (DPI)6. Selv om det har vært tidligere studier som bruker agroinjeksjon av virale vektorer i mais, har disse forsøkene bare vist at agroinjeksjon kan lette virusinfeksjon fra en smittsom klone i maisplanter og ikke utvide til rekombinante virus designet for VIGS- eller VOX-applikasjoner19,20,21,22. Protokollen som presenteres her bygger på tidligere agroinjeksjonsmetoder, spesielt Grismley et al.19. Totalt sett er denne agroinjeksjonsmetoden kompatibel med VIGS- og VOX-vektorer, krever ikke spesialisert utstyr eller alternative verter som inokulumkilder, og reduserer den totale tiden og kostnadene som kreves for å sette opp og utføre inokulasjoner i forhold til andre vanlige metoder som krever biolistikk eller in vitro transkripsjon. Denne protokollen vil legge til rette for funksjonelle genomikkstudier i mais med applikasjoner som involverer VIGS, VOX og VEdGE.
Agrobacterium er et viktig verktøy som letter mange molekylærbiologiske teknikker i planterelatert forskning. Denne studien gir en agroinjeksjonsprotokoll for inokulerende FoMV- og SCMV-virusvektorer direkte i maisvev for VIGS- og VOX-applikasjoner. Hovedmålet er å øke enkelheten og nytten av virusbaserte teknologier for forskning på monokotavlingsanlegg. Selv om direkte agroinokulasjon av mais har blitt rapportert for noen få virus, er forfatterne ikke klar over en detaljert protokoll, og det er ingen eksempler på VIGS- og VOX-applikasjoner i disse studiene19,22.
Det har blitt rapportert, og ble bekreftet under utviklingen av denne protokollen, at injeksjonsstedet er en nøkkelfaktor for vellykket lansering av en systemisk virusinfeksjon via agroinjection19. Konsekvent injisering av den anbefalte plasseringen på anlegget antas å være den største variabelen, fordi den nøyaktige posisjonen til meristem i maisplanter er praktisk talt uoppdagelig for øyet. For å minimere mellommenneskelig variasjon anbefales det å dissekere noen maisplanter ned til meristem for bedre å visualisere plasseringen (figur 3C). Meristems posisjon i forhold til coleoptilar-noden skal være omtrent den samme for planter i alderen 4-7 dager. I tillegg gir praktisering av injeksjon med farget væske en lett synlig demonstrasjon av hvordan “inoculum” fyller bladhylsen, og fordi injeksjonsstedet er merket med fargestoff, kan nøyaktigheten av injeksjonsstedet bekreftes (figur 3G, H). Meristematisk vev er mest utsatt for agroinjeksjon, men injisering av Agrobacterium suspensjoner direkte i dette vevet resulterer i uønskede morfologiske effekter (Figur 6)19. Planter med skadede meristems overlever, men de resulterende feilene er uønskede, og dermed bør direkte injeksjon av dette vevet unngås.
Det er flere variabler som kan påvirke vellykket lansering av en systemisk virusinfeksjon via agroinjeksjon fordi tre komplekse biologiske systemer (plante-, virus- og Agrobacterium-stamme) må samhandle i koordinering. Dette komplekse samspillet kan hjelpes av de raskt delte cellene i den meristematiske regionen, noe som gjør det til et ideelt sted for agroinokulasjon19. Agrobacteriumstammen må kunne infisere celler i plantevevet for å levere T-DNA som bærer det virale genomet, og anlegget må være utsatt for viruset for å initiere viral replikasjon og systemisk infeksjon. Maisgenotyper varierer i deres følsomhet for virus (f.eks. Mo17 er resistent mot FoMV) eller Agrobacterium stammer, men flertallet som ble testet synes å være utsatt for både FoMV og SCMV (Tabell 1 og Tabell 2)53. For eksempel kan innavlslinjen FR1064 og den søte maissorten Golden Bantam være spesielt utsatt for både GV3101 Agrobacterium og FoMV-baserte vektorer.
Bladnummeret som er samplet og tidspunktet for prøvetaking for RT-PCR er avgjørende for nøyaktig vurdering av virusinfeksjon. I eksemplene som vises her, ble bladnummeret bestemt ved å starte ved det første avrundede bladet (kjent som “tommelbladet”) og telle oppover. Bladene ble samplet når de ble utvidet og neste blad hadde begynt å dukke opp. Hvilke blader som er optimale for prøvetaking, kan imidlertid variere basert på virusarter som brukes, vekstforhold og maisgenotype. Derfor anbefales et første tidskurseksperiment når du bruker denne protokollen på et nytt virussystem for å optimalisere prøvetakingsstrategien med hensyn til blader og timing.
Den spesifikke konstruksjonen som brukes, påvirker effektiviteten til denne protokollen betydelig. For eksempel produserer de tomme vektorene, FoMV-EV og SCMV-EV, og FoMV-PDS og FoMV-LES22, som begge inneholder små innsatser (henholdsvis 313 bp og 329 bp), vanligvis de høyeste prosentandelene av planter med virussymptomer i disse eksperimentene (tabell 1 og tabell 2). Rekombinante virus som bærer større innsatser av GFP ORF (720 bp) i FoMV-GFP og SCMV-GFP, hadde imidlertid mye lavere infeksjonsrater sammenlignet med planter injisert med de tomme vektor- eller genaktiveringskonstruksjonene. Denne trenden kan skyldes de negative virkningene på viral kondisjon forårsaket av økende mengder eksogent genetisk materiale i det virale genomet. Flere studier har vist at innsettingsstabiliteten til plantens virale vektorer i stor grad er avhengig av innsatsstørrelse og sekvens36,54,55,56,57. I tillegg var det en merkbar forskjell i prosentandel av planter som blir smittet etter inokulering med enten FoMV eller SCMV tom vektor, noe som tyder på at ytterligere arbeid er nødvendig for å optimalisere denne protokollen for SCMV (tabell 1). Disse resultatene indikerer at noe feilsøking kan være nødvendig når du utvikler en konstruksjon, fordi både sekvensen og lengden på fragmentet kan påvirke effektiviteten.
Totalt sett har denne studien vist at agroinjeksjon av maisplanter er en effektiv inokulasjonsmetode for to forskjellige RNA-plantevirus, flere vektorkonfigurasjoner og 11 genotyper mais. Dette arbeidet med FoMV og SCMV, sammen med tidligere arbeider som bruker injeksjon med maisklorittvirus (MCMV) eller MSV, indikerer at agroinjeksjon er egnet for inokulerende maisplanter med smittsomme kloner av både RNA- og DNA-virus19,20,21,22. I tillegg viser dette arbeidet videre at agroinjeksjon er en levedyktig metode for VIGS- og VOX-vektorer og kan brukes på planter så unge som fire dager gamle (tabell 3). Protokollen som presenteres her forventes å bli lett tilpasset av maisbiologer for å lette forskning i funksjonelle genomikkstudier som involverer forbigående genaktivering (VIGS) og overekspression (VOX). Agroinjection har også kapasitet til å legge til rette for virusbaserte genredigeringsmetoder (VEdGE) som ellers ville være begrenset av avhengighet av plantetransformasjon, noe som potensielt kan forbedre redigeringseffektiviteten samt tilgjengelighet58,59,60. Gitt riktig Agrobacterium stamme, mais genotyper, og virale vektorer er gjennomtenkt kombinert, inokulering av agroinjection forventes å bli et verdifullt verktøy for forbigående genfunksjonsanalyser i mais.
The authors have nothing to disclose.
Iowa State University er en del av et team som støtter DARPA’s Insect Allies program HR0011-17-2-0053. Dette arbeidet ble også støttet av Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch prosjektnummer 3808 og State of Iowa Funds. K.L.H. ble også delvis støttet av Iowa State University Predictive Plant Phenomics graduate training program finansiert av National Science Foundation (DGE #1545453) og av Agricultural and Food Research Initiative grant no. 2019-07318 fra USDA National Institute of Food and Agriculture. Finansiører hadde ingen rolle i utformingen av studiet og innsamling, analyse og tolkning av data og skriftlig manuskriptet. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner eller anbefalinger uttrykt i dette materialet er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis fundernes synspunkter.
Vi takker Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) for frø av mais innavl linjer, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) for å gjøre FoMV-GFP klone, og Tyler Austin (Iowa State University) for teknisk assistanse.
1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
37°C Incubator | For E. coli | ||
Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
Ethanol | For RNA extraction | ||
Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
Fluorescence Microscope | |||
Gel Electrophoresis Box | |||
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
PacI | New England Biolabs | R0547 | |
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
pH Meter | |||
Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
Thermocycler | For PCR | ||
Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
XbaI | New England Biolabs | R0145 |