सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर प्रोटोकॉल
Summary
यह काम दो रंग डीडीपीसीआर प्रणाली का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए विभिन्न परख विकसित करने पर चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है। चरण विस्तृत हैं और परख और प्रयोग प्रदर्शन में सुधार करने के तरीके पर नोट्स शामिल किए गए हैं। इन परखों का उपयोग कई सार्स-सीओवी-2 आरटी-डीडीपीसीआर अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
Abstract
सार्स-सीओवी-2 महामारी का निदान दुनिया भर के सभी देशों के लिए प्राथमिकता है। वर्तमान में, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन क्वांटिटेटिव पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) सार्स-सीओवी-2 निदान के लिए स्वर्ण मानक है क्योंकि कोई स्थायी समाधान उपलब्ध नहीं है। हालांकि यह तकनीक प्रभावी हो सकती है, अनुसंधान पता लगाने और निदान में अपनी सीमाओं को दिखाते हुए उभरा है, खासकर जब यह कम प्रचुर लक्ष्यों की बात आती है। इसके विपरीत, ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर), क्यूपीसीआर पर बेहतर लाभ के साथ एक हालिया उभरती हुई तकनीक है, जिसे कम प्रचुर मात्रा में लक्षित नमूनों से सार्स-सीओवी-2 के निदान में आरटी-क्यूपीसीआर की चुनौतियों को दूर करने के लिए दिखाया गया है। भावी प्रभाव से, इस लेख में, आरटी-डीडीपीसीआर की क्षमताओं को दो-रंग पहचान प्रणाली का उपयोग करके सिम्प्लेक्स, डुप्लेक्स, ट्रिपलएक्स प्रोब मिक्स और चौगुनी परख विकसित करने के तरीके के बारे में कदम दिखाकर आगे बढ़ाया गया है। सार्स-सीओवी-2 जीनोम (एन, ओआरएफ1एबी, आरपीपी30 और आरबीडी2) के विशिष्ट स्थलों को लक्षित करने वाले प्राइमरों और जांचों का उपयोग करते हुए, इन परखों का विकास संभव दिखाया गया है। इसके अतिरिक्त, एसेस वर्कफ़्लो को बेहतर बनाने और डेटा का विश्लेषण करने के तरीके पर चरण-दर-चरण विस्तृत प्रोटोकॉल, नोट्स और सुझाव प्रदान किए जाते हैं। भविष्य के कार्यों में इस वर्कफ़्लो को अपनाने से यह सुनिश्चित होगा कि लागत और नमूना थ्रूपुट में काफी सुधार करने वाले एक छोटे से नमूने में लक्ष्यों की अधिकतम संख्या का संवेदनशील रूप से पता लगाया जा सकता है।
Introduction
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त तकनीक, न्यूक्लिक एसिड अनुसंधान के उत्तर प्रदान करने में सक्षम एक शक्तिशाली तकनीक बनने के अपने आगमन के बाद से कई परिवर्तनों से गुजरी है। ये परिवर्तन पुरानी तकनीक का निरंतर सुधार रहे हैं। इन परिवर्तनों को तीन पीढ़ियों में संक्षेपित किया जा सकताहै। पहली पीढ़ी पारंपरिक पीसीआर है जो प्रवर्धित लक्ष्यों की मात्रा निर्धारित करने और पता लगाने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन पर निर्भर करती है। दूसरी पीढ़ी मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूपीसीआर) है जो वास्तविक समय में नमूनों का पता लगा सकती है और एक नमूने में लक्ष्यों को सीधे निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र पर भरोसा कर सकती है। तीसरी पीढ़ी, डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर), मानक वक्र की आवश्यकता के बिना न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों का पता लगाने और पूर्ण परिमाणीकरण दोनों कर सकती है। डीपीसीआर को एक दीवार के कुओं द्वारा तेल, पानी के इमल्शन में अलग किए जाने वाले प्रतिक्रिया कक्षों से और भी सुधार किया गया है, और उसी कुएं के भीतर रसायनों को स्थिर किया जा रहा है जैसा कि बूंद-आधारित डिजिटल पीसीआर 2 में देखागया है। ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर (डीडीपीसीआर) में, एक नमूने को हजारों नैनोलीटर आकार की बूंदों में विभाजित किया जाता है जिसमें व्यक्तिगत लक्ष्य होते हैं जिन्हें बाद में पॉइसन सांख्यिकी 2,3,4 का उपयोग करके परिमाणित किया जाएगा। यह तकनीक पीसीआर की अन्य पीढ़ियों की तुलना में कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्यों को निर्धारित करने में डीडीपीसीआर को बढ़त देती है।
हाल ही में, कई अनुप्रयोगों ने कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य 1,5,6 का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करते समय आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले क्यूपीसीआर पर डीडीपीसीआर की श्रेष्ठता पर प्रकाश डाला है। सार्स-सीओवी-2 इन अनुप्रयोगों 7,8,9,10,11,12 का कोई अपवाद नहीं है। सार्स-सीओवी-2 के प्रकोप के बाद से, वैज्ञानिक वायरस का निदान करने और इसे कुशलता से पता लगाने के तरीके पर समाधान के साथ आने के लिए सभी मोर्चों पर काम कर रहे हैं। सोने का मौजूदा मानक अभी भी क्यूपीसीआर13 बना हुआ है। हालांकि आरटी-डीडीपीसीआर को आरटी-क्यूपीसीआर 7,8,9,10,11,12 की तुलना में पर्यावरण और नैदानिक दोनों नमूनों से कम प्रचुर मात्रा में सार्स-सीओवी-2 लक्ष्यों का पता लगाने में अधिक सटीक दिखाया गया है। सार्स-सीओवी-2 डीडीपीसीआर द्वारा प्रकाशित अधिकांश काम वाणिज्यिक परखों के आधार पर मल्टीप्लेक्स के साथ सिम्प्लेक्स परख पर निर्भर करते हैं। इसलिए, सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स आरटी-डीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके को समझाने के लिए और अधिक किया जाना चाहिए।
एक उचित परख डिजाइन में, मल्टीप्लेक्सिंग का उपयोग लागत को बचाने, नमूना थ्रूपुट बढ़ाने और लक्ष्यों की संख्या को अधिकतम करने के लिए किया जा सकता है जिन्हें एक छोटे से नमूने के भीतर संवेदनशील रूप से पता लगाया जा सकता है। डीडीपीसीआर के साथ मल्टीप्लेक्सिंग करते समय, किसी को यह ध्यान रखना चाहिए कि किसी विशेष प्रणाली में कितने फ्लोरोफोर का पता लगाया जा सकता है। कुछ डीडीपीसीआर प्लेटफॉर्म तीन चैनलों का समर्थन कर सकते हैं जबकि अन्य केवल दो चैनलों का समर्थन करते हैं। इसलिए, दो चैनलों के साथ मल्टीप्लेक्सिंग करते समय, किसी को दो से अधिकलक्ष्यों 14,15,16 का पता लगाने के लिए उच्च क्रम मल्टीप्लेक्सिंग सहित विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करना पड़ता है। इस काम में, दो रंगों की डीडीपीसीआर डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग विभिन्न सार्स-सीओवी-2 आरटी-डीडीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके पर चरण दिखाने के लिए किया जाता है, जिन्हें विभिन्न शोध अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए आरटी-डीडीपीसीआर परख विकसित करने के तरीके पर कुछ संसाधन उपलब्ध हैं। हालांकि इस लेख में उपयोग नहीं किया गया है, ज्ञात प्रतियों के साथ मानक नमूने का उपयोग परख विकसित करने औ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को चीन के स्वास्थ्य मंत्रालय से संक्रामक रोग नियंत्रण के मेगाप्रोजेक्ट, अनुदान संख्या 2017 जेडएक्स 10302301-005 और चीन-अफ्रीका संयुक्त अनुसंधान केंद्र, अनुदान संख्या एसएजेसी 201605 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
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