Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2
Summary
В этой работе обобщены шаги по разработке различных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Шаги проработаны, и были включены примечания о том, как улучшить анализы и результаты экспериментов. Эти анализы могут использоваться для нескольких приложений SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
Диагностика продолжающейся пандемии SARS-CoV-2 является приоритетом для всех стран мира. В настоящее время количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, поскольку постоянного решения нет. Каким бы эффективным ни был этот метод, появились исследования, показывающие его ограничения в обнаружении и диагностике, особенно когда речь идет о малораспространенных мишенях. Напротив, было показано, что капельная цифровая ПЦР (ddPCR), недавно появившаяся технология с превосходными преимуществами по сравнению с кПЦР, преодолевает проблемы ОТ-кПЦР в диагностике SARS-CoV-2 из малораспространенных целевых образцов. В перспективе в этой статье возможности ОТ-дПЦР еще больше расширяются за счет демонстрации шагов по разработке симплексных, дуплексных, триплексных зондовых смесей и квадруплексных анализов с использованием двухцветной системы детектирования. Показано, что разработка этих анализов возможна с использованием праймеров и зондов, нацеленных на определенные участки генома SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 и RBD2). Кроме того, предоставляются пошаговые подробные протоколы, примечания и предложения о том, как улучшить рабочий процесс анализа и анализа данных. Адаптация этого рабочего процесса в будущих работах обеспечит возможность чувствительного обнаружения максимального количества целей в небольшой выборке, что значительно снизит стоимость и пропускную способность выборки.
Introduction
Полимеразная цепная реакция (ПЦР), хорошо известная методика, с момента своего появления претерпела несколько трансформаций и стала мощным методом, способным дать ответы на исследования нуклеиновых кислот. Эти преобразования были постоянным совершенствованием старой техники. Эти преобразования можно свести к тремпоколениям1. Первое поколение – это обычная ПЦР, которая основана на гель-электрофорезе для количественной оценки и обнаружения амплифицированных мишеней. Второе поколение — это количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), которая может обнаруживать образцы в режиме реального времени и полагаться на стандартную кривую для прямого количественного определения целей в образце. Третье поколение, цифровая ПЦР (дПЦР), может выполнять как обнаружение, так и абсолютное количественное определение мишеней нуклеиновых кислот без необходимости стандартной кривой. дПЦР также была усовершенствована за счет того, что реакционные камеры были разделены скважинами стенки на эмульсии нефти, воды и стабилизирующих химических веществ в той же лунке, что и при цифровой ПЦР2 на основе капель. При капельной цифровой ПЦР (ddPCR) образец разбивается на тысячи капель нанолитрового размера, содержащих отдельные мишени, которые позже будут количественно определены с использованием статистики Пуассона 2,3,4. Этот метод дает ddPCR преимущество в количественной оценке малораспространенных мишеней по сравнению с другими поколениями ПЦР.
В последнее время во многих приложениях подчеркивается превосходство ddPCR над широко используемой qPCR при обнаружении и количественной оценке малораспространенных мишеней 1,5,6. SARS-CoV-2 не является исключением из этих приложений 7,8,9,10,11,12. С момента вспышки SARS-CoV-2 ученые работали на всех фронтах, чтобы найти решения о том, как диагностировать вирус и эффективно его обнаруживать. Нынешним золотым стандартом по-прежнему остается qPCR13. Однако было показано, что ОТ-дПЦР более точна при обнаружении малораспространенных мишеней SARS-CoV-2 как из экологических, так и из клинических образцов по сравнению с ОТ-кПЦР 7,8,9,10,11,12. Большинство опубликованных работ по ddPCR SARS-CoV-2 основаны на симплексных анализах, а мультиплексные – на коммерческих анализах. Следовательно, необходимо сделать больше, чтобы объяснить, как разрабатывать мультиплексные анализы ОТ-дПЦР для обнаружения SARS-CoV-2.
При правильном дизайне анализа мультиплексирование может быть использовано для экономии затрат, увеличения пропускной способности образца и максимизации количества мишеней, которые могут быть чувствительно обнаружены в небольшом образце. При мультиплексировании с помощью ddPCR необходимо учитывать, сколько флуорофоров может быть обнаружено в конкретной системе. Некоторые платформы ddPCR могут поддерживать до трех каналов, в то время как другие поддерживают только два канала. Следовательно, при мультиплексировании с двумя каналами приходится использовать разные подходы, в том числе мультиплексирование более высокого порядка для обнаружения более двух целей14,15,16. В этой работе двухцветная система обнаружения ddPCR используется для демонстрации шагов по разработке различных анализов SARS-CoV-2 RT-ddPCR, которые можно адаптировать для различных исследовательских приложений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует мало ресурсов о том, как разрабатывать анализы RT-ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2. Хотя стандартные образцы с известными копиями не используются в этой статье, они могут быть использованы для разработки и оптимизации анализов. Однако в этой работе образцы SARS-CoV-2, выращенные в клетка?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано Мегапроектом по борьбе с инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Китая, номер гранта 2017ZX10302301-005 и Китайско-африканским совместным исследовательским центром, номер гранта SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
