Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2
Summary
Questo lavoro riassume i passaggi nello sviluppo di diversi saggi per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. I passaggi sono elaborati e sono state incluse note su come migliorare i test e le prestazioni dell’esperimento. Questi test possono essere utilizzati per molteplici applicazioni SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
La diagnosi della pandemia di SARS-CoV-2 in corso è una priorità per tutti i paesi del mondo. Attualmente, la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) è il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2 in quanto non è disponibile una soluzione permanente. Per quanto efficace possa essere questa tecnica, la ricerca è emersa mostrando i suoi limiti nel rilevamento e nella diagnosi, specialmente quando si tratta di obiettivi a bassa abbondanza. Al contrario, la PCR digitale a goccia (ddPCR), una recente tecnologia emergente con vantaggi superiori rispetto alla qPCR, ha dimostrato di superare le sfide della RT-qPCR nella diagnosi di SARS-CoV-2 da campioni bersaglio a bassa abbondanza. In prospettiva, in questo articolo, le capacità di RT-ddPCR sono ulteriormente ampliate mostrando i passaggi su come sviluppare saggi simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. Utilizzando primer e sonde mirati a siti specifici del genoma di SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), lo sviluppo di questi saggi si è dimostrato possibile. Inoltre, vengono forniti protocolli dettagliati, note e suggerimenti passo dopo passo su come migliorare il flusso di lavoro dei saggi e analizzare i dati. L’adattamento di questo flusso di lavoro nei lavori futuri garantirà che il numero massimo di obiettivi possa essere rilevato in modo sensibile in un piccolo campione, migliorando significativamente i costi e la produttività del campione.
Introduction
La reazione a catena della polimerasi (PCR), una tecnica ben riconosciuta, ha subito diverse trasformazioni dal suo avvento per diventare una tecnica potente in grado di fornire risposte alla ricerca sugli acidi nucleici. Queste trasformazioni sono state un costante miglioramento della vecchia tecnica. Queste trasformazioni possono essere riassunte in tre generazioni1. La prima generazione è la PCR convenzionale che si basa sull’elettroforesi su gel per quantificare e rilevare bersagli amplificati. La seconda generazione è la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) in grado di rilevare campioni in tempo reale e fare affidamento su una curva standard per quantificare direttamente i bersagli in un campione. La terza generazione, la PCR digitale (dPCR), può eseguire sia il rilevamento che la quantificazione assoluta dei bersagli degli acidi nucleici senza la necessità di una curva standard. La dPCR è stata ulteriormente migliorata dalle camere di reazione separate dai pozzetti di una parete in emulsioni di olio, acqua e sostanze chimiche stabilizzanti all’interno dello stesso pozzo come visto nellaPCR digitale 2 basata su goccioline. Nella PCR digitale a goccia (ddPCR), un campione viene partizionato in migliaia di goccioline di dimensioni nanolitri contenenti singoli bersagli che saranno successivamente quantificati utilizzando le statistiche di Poisson 2,3,4. Questa tecnica dà alla ddPCR un vantaggio nel quantificare bersagli a bassa abbondanza rispetto alle altre generazioni di PCR.
Recentemente, molteplici applicazioni hanno evidenziato la superiorità della ddPCR rispetto alla qPCR comunemente usata nel rilevare e quantificare bersagli a bassa abbondanza 1,5,6. SARS-CoV-2 non fa eccezione a queste applicazioni 7,8,9,10,11,12. Dall’epidemia di SARS-CoV-2, gli scienziati hanno lavorato su tutti i fronti per trovare soluzioni su come diagnosticare il virus e rilevarlo in modo efficiente. L’attuale gold standard deve ancora essere qPCR13. Tuttavia, RT-ddPCR ha dimostrato di essere più accurato nel rilevare bersagli SARS-CoV-2 a bassa abbondanza da campioni sia ambientali che clinici rispetto a RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La maggior parte dei lavori pubblicati su SARS-CoV-2 ddPCR dipendono da saggi simplex con quelli multiplex che dipendono da saggi commerciali. Quindi, si dovrebbe fare di più per spiegare come sviluppare saggi RT-dPCR multiplex per il rilevamento di SARS-CoV-2.
In un corretto progetto di analisi, il multiplexing può essere utilizzato per risparmiare sui costi, aumentare la produttività del campione e massimizzare il numero di obiettivi che possono essere rilevati in modo sensibile all’interno di un campione piccolo. Quando si esegue il multiplexing con ddPCR, si deve tenere conto di quanti fluorofori possono essere rilevati in un particolare sistema. Alcune piattaforme ddPCR possono supportare fino a tre canali, mentre altre supportano solo due canali. Quindi, quando si esegue il multiplexing con due canali, è necessario utilizzare approcci diversi, incluso il multiplexing di ordine superiore per rilevare più di due target14,15,16. In questo lavoro, un sistema di rilevamento ddPCR a due colori viene utilizzato per mostrare i passaggi su come sviluppare diversi saggi SARS-CoV-2 RT-ddPCR che possono essere adattati per diverse applicazioni di ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sono disponibili poche risorse su come sviluppare saggi RT-ddPCR per il rilevamento di SARS-CoV-2. Sebbene non utilizzati in questo articolo, i campioni standard con copie note possono essere utilizzati per sviluppare e ottimizzare i saggi. In questo lavoro, tuttavia, i campioni di SARS-CoV-2 cresciuti in cellule Vero-E6 sono stati inseriti in uno sfondo di RNA genomico umano e utilizzati come campioni standard per sviluppare i saggi. Sequenze di primer e sonde adeguate sono essenziali quando si sviluppano saggi. Poiché…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata da Megaproject of Infectious Disease Control del Ministero della Salute della Cina, numero di sovvenzione 2017ZX10302301-005 e Sino-Africa Joint Research Center, numero di sovvenzione SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
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