To-trinns omvendt transkripsjon dråpe digitale PCR-protokoller for SARS-CoV-2 deteksjon og kvantifisering
Summary
Dette arbeidet oppsummerer trinn for å utvikle forskjellige analyser for SARS-CoV-2-deteksjon ved hjelp av et tofarget ddPCR-system. Trinnene er forseggjorte og notater er inkludert om hvordan du kan forbedre analysene og eksperimentytelsen. Disse analysene kan brukes til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikasjoner.
Abstract
Diagnostisering av den pågående SARS-CoV-2-pandemien er en prioritet for alle land over hele verden. For tiden er revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) gullstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da ingen permanent løsning er tilgjengelig. Uansett hvor effektiv denne teknikken kan være, har det kommet forskning som viser sine begrensninger i deteksjon og diagnose, spesielt når det gjelder lave rikelige mål. I motsetning til dette har dråpe digital PCR (ddPCR), en nylig fremvoksende teknologi med overlegne fordeler i forhold til qPCR, vist seg å overvinne utfordringene med RT-qPCR i diagnostisering av SARS-CoV-2 fra lave rikelig målprøver. Prospektivt, i denne artikkelen, utvides mulighetene til RT-ddPCR ytterligere ved å vise trinn for hvordan du utvikler simplex, duplex, triplex probe mix og quadruplex analyser ved hjelp av et tofargedeteksjonssystem. Ved å bruke primere og prober rettet mot spesifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2), er utviklingen av disse analysene vist å være mulig. I tillegg gis detaljerte protokoller, notater og forslag til hvordan du kan forbedre analysearbeidsflyten og analysere data. Tilpasning av denne arbeidsflyten i fremtidige arbeider vil sikre at maksimalt antall mål kan oppdages følsomt i et lite utvalg, noe som forbedrer kostnadene og prøvegjennomstrømningen betydelig.
Introduction
Polymerasekjedereaksjon (PCR), en anerkjent teknikk, har gjennomgått flere transformasjoner siden adventen for å bli en kraftig teknikk som er i stand til å gi svar på nukleinsyreforskning. Disse transformasjonene har vært en konstant forbedring av den gamle teknikken. Disse transformasjonene kan oppsummeres i tre generasjoner1. Den første generasjonen er konvensjonell PCR som er avhengig av gelelektroforese for å kvantifisere og oppdage forsterkede mål. Den andre generasjonen er kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) som kan oppdage prøver i sanntid og stole på en standardkurve for direkte kvantifisering av mål i en prøve. Den tredje generasjonen, digital PCR (dPCR), kan utføre både deteksjon og absolutt kvantifisering av nukleinsyremål uten behov for en standardkurve. dPCR har også blitt forbedret ytterligere fra reaksjonskamre som separeres av brønnene i en vegg til emulsjoner av olje, vann og stabiliserende kjemikalier i samme brønn som sett i dråpebasert digital PCR2. I dråpedigital PCR (ddPCR) deles en prøve inn i tusenvis av dråper i nanoliterstørrelse som inneholder individuelle mål som senere skal kvantifiseres ved hjelp av Poisson-statistikk 2,3,4. Denne teknikken gir ddPCR en fordel i å kvantifisere mål med lav rikelig sammenlignet med de andre generasjonene av PCR.
Nylig har flere applikasjoner fremhevet overlegenheten til ddPCR over den ofte brukte qPCR når man oppdager og kvantifiserer mål med lav mengde 1,5,6. SARS-CoV-2 er intet unntak fra disse applikasjonene 7,8,9,10,11,12. Siden utbruddet av SARS-CoV-2 har forskere jobbet på alle fronter for å komme opp med løsninger på hvordan man diagnostiserer viruset og oppdager det effektivt. Den nåværende gullstandarden gjenstår fortsatt å være qPCR13. Imidlertid har RT-ddPCR vist seg å være mer nøyaktig når det gjelder å oppdage lave mengder SARS-CoV-2-mål fra både miljømessige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste av SARS-CoV-2 ddPCR-publiserte verk er avhengige av simplex-analyser med multipleksene, avhengig av kommersielle analyser. Derfor bør mer gjøres for å forklare hvordan man utvikler multiplekse RT-dPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon.
I en riktig analysedesign kan multipleksing brukes til å spare kostnader, øke prøvegjennomstrømningen og maksimere antall mål som kan oppdages følsomt i en liten prøve. Ved multipleksing med ddPCR må man ta hensyn til hvor mange fluoroforer som kan detekteres i et bestemt system. Noen ddPCR-plattformer kan støtte opptil tre kanaler, mens andre bare støtter to kanaler. Derfor, når multipleksing med to kanaler, må man bruke forskjellige tilnærminger, inkludert høyere ordens multipleksing for å oppdage mer enn to mål14,15,16. I dette arbeidet brukes et tofarget ddPCR-deteksjonssystem for å vise trinn for hvordan man utvikler forskjellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan tilpasses for forskjellige forskningsapplikasjoner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Få ressurser er tilgjengelige for hvordan man utvikler RT-ddPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon. Selv om det ikke brukes i denne artikkelen, kan standardprøver med kjente kopier brukes til å utvikle og optimalisere analyser. I dette arbeidet ble imidlertid SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler pigget i en bakgrunn av humant genomisk RNA og brukt som standardprøver for å utvikle analysene. Riktig primer- og sondesekvenser er avgjørende når du utvikler analyser. Siden det meste av forarbeidet på SARS-CoV-2 R…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Megaproject of Infectious Disease Control fra Helsedepartementet i Kina, tilskuddsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, tilskuddsnummer SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
