To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering
Summary
Dette arbejde opsummerer trin til udvikling af forskellige assays til SARS-CoV-2-detektion ved hjælp af et tofarvet ddPCR-system. Trinene er detaljerede, og der er inkluderet noter om, hvordan man forbedrer assays og eksperimentets ydeevne. Disse assays kan bruges til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.
Abstract
Diagnose af den igangværende SARS-CoV-2-pandemi er en prioritet for alle lande over hele kloden. I øjeblikket er omvendt transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) guldstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da der ikke findes nogen permanent løsning. Uanset hvor effektiv denne teknik kan være, er der opstået forskning, der viser dens begrænsninger i detektion og diagnose, især når det kommer til lave rigelige mål. I modsætning hertil har dråbedigital PCR (ddPCR), en nylig ny teknologi med overlegne fordele i forhold til qPCR, vist sig at overvinde udfordringerne ved RT-qPCR ved diagnosticering af SARS-CoV-2 fra lave rigelige målprøver. Fremadrettet udvides mulighederne i RT-ddPCR i denne artikel yderligere ved at vise trin til, hvordan man udvikler simplex-, duplex-, triplex-sondemix og quadruplex-assays ved hjælp af et tofarvet detektionssystem. Ved hjælp af primere og sonder rettet mod specifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2) er udviklingen af disse assays vist at være mulig. Derudover leveres trin for trin detaljerede protokoller, noter og forslag til, hvordan du forbedrer analysearbejdsgangen og analyserer data. Tilpasning af denne arbejdsgang i fremtidige arbejder vil sikre, at det maksimale antal mål kan detekteres følsomt i en lille stikprøve, hvilket forbedrer omkostningerne og prøvegennemløbet betydeligt.
Introduction
Polymerasekædereaktion (PCR), en velkendt teknik, har gennemgået flere transformationer siden dens fremkomst for at blive en kraftfuld teknik, der er i stand til at give svar på nukleinsyreforskning. Disse transformationer har været en konstant forbedring af den gamle teknik. Disse transformationer kan opsummeres i tre generationer1. Den første generation er konventionel PCR, der er afhængig af gelelektroforese til at kvantificere og detektere forstærkede mål. Anden generation er kvantitativ realtids PCR (qPCR), der kan detektere prøver i realtid og stole på en standardkurve til direkte kvantificering af mål i en prøve. Den tredje generation, digital PCR (dPCR), kan udføre både detektion og absolut kvantificering af nukleinsyremål uden behov for en standardkurve. dPCR er også blevet forbedret yderligere fra reaktionskamre, der adskilles af brøndene i en væg til emulsioner af olie, vand og stabiliserende kemikalier inden for samme brønd som set i dråbebaseret digital PCR2. I dråbe digital PCR (ddPCR) opdeles en prøve i tusindvis af nanoliter-store dråber, der indeholder individuelle mål, som senere vil blive kvantificeret ved hjælp af Poisson-statistik 2,3,4. Denne teknik giver ddPCR en fordel ved kvantificering af mål med lav overflod sammenlignet med de andre generationer af PCR.
For nylig har flere applikationer fremhævet overlegenheden af ddPCR i forhold til den almindeligt anvendte qPCR ved påvisning og kvantificering af målmed lavt rigelige mål 1,5,6. SARS-CoV-2 er ingen undtagelse fra disse applikationer 7,8,9,10,11,12. Siden udbruddet af SARS-CoV-2 har forskere arbejdet på alle fronter for at komme med løsninger på, hvordan man diagnosticerer virussen og opdager den effektivt. Den nuværende guldstandard mangler stadig at være qPCR13. RT-ddPCR har imidlertid vist sig at være mere nøjagtig til at detektere lave rigelige SARS-CoV-2-mål fra både miljømæssige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste af de SARS-CoV-2 ddPCR-offentliggjorte værker afhænger af simpleksassays med multiplexerne afhængigt af kommercielle assays. Derfor bør der gøres mere for at forklare, hvordan man udvikler multiplex RT-dPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion.
I et korrekt analysedesign kan multiplexing bruges til at spare på omkostningerne, øge prøvegennemstrømningen og maksimere antallet af mål, der følsomt kan detekteres inden for en lille prøve. Ved multiplexing med ddPCR skal man tage højde for, hvor mange fluoroforer der kan detekteres i et bestemt system. Nogle ddPCR-platforme kan understøtte op til tre kanaler, mens andre kun understøtter to kanaler. Derfor, når multiplexing med to kanaler, skal man bruge forskellige tilgange, herunder multiplexing af højere orden for at detektere mere end to mål14,15,16. I dette arbejde bruges et tofarvet ddPCR-detektionssystem til at vise trin til, hvordan man udvikler forskellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays, der kan tilpasses til forskellige forskningsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er få ressourcer til rådighed om, hvordan man udvikler RT-ddPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion. Selvom de ikke bruges i denne artikel, kan standardprøver med kendte kopier bruges til at udvikle og optimere assays. I dette arbejde blev SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler imidlertid spiket i en baggrund af humant genomisk RNA og brugt som standardprøver til at udvikle analyserne. Korrekte primer- og sondesekvenser er afgørende, når der udvikles assays. Da det meste indledende arbejde med SARS-CoV-2 RT-ddP…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af Megaproject of Infectious Disease Control fra Kinas sundhedsministerium, bevillingsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, bevillingsnummer SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
