Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering
Summary
Detta arbete sammanfattar steg för att utveckla olika analyser för SARS-CoV-2-detektering med ett tvåfärgs ddPCR-system. Stegen är detaljerade och anteckningar har inkluderats om hur man förbättrar analyserna och experimentprestandan. Dessa analyser kan användas för flera SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.
Abstract
Diagnos av den pågående SARS-CoV-2-pandemin är en prioritet för alla länder över hela världen. För närvarande är kvantitativ PCR med omvänd transkription (RT-qPCR) guldstandarden för SARS-CoV-2-diagnos eftersom ingen permanent lösning finns tillgänglig. Hur effektiv denna teknik än kan vara, har forskning framkommit som visar dess begränsningar i upptäckt och diagnos, särskilt när det gäller låga rikliga mål. Däremot har droplet digital PCR (ddPCR), en ny framväxande teknik med överlägsna fördelar jämfört med qPCR, visat sig övervinna utmaningarna med RT-qPCR vid diagnos av SARS-CoV-2 från låga rikliga målprover. Prospektivt, i den här artikeln, utökas funktionerna i RT-ddPCR ytterligare genom att visa steg för hur man utvecklar simplex-, duplex-, triplex-sondblandning och quadruplex-analyser med hjälp av ett tvåfärgsdetekteringssystem. Med hjälp av primers och sonder riktade mot specifika platser i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 och RBD2) har utvecklingen av dessa analyser visat sig vara möjlig. Dessutom tillhandahålls detaljerade protokoll, anteckningar och förslag på hur man kan förbättra analysarbetsflödet och analysera data. Att anpassa detta arbetsflöde i framtida arbeten kommer att säkerställa att det maximala antalet mål kan identifieras känsligt i ett litet urval, vilket avsevärt förbättrar kostnaden och provgenomströmningen.
Introduction
Polymeraskedjereaktion (PCR), en välkänd teknik, har genomgått flera omvandlingar sedan dess tillkomst för att bli en kraftfull teknik som kan ge svar på nukleinsyraforskning. Dessa omvandlingar har varit en ständig förbättring av den gamla tekniken. Dessa omvandlingar kan sammanfattas i tre generationer1. Den första generationen är konventionell PCR som bygger på gelelektrofores för att kvantifiera och detektera förstärkta mål. Den andra generationen är kvantitativ realtids-PCR (qPCR) som kan detektera prover i realtid och förlita sig på en standardkurva för att direkt kvantifiera mål i ett prov. Den tredje generationen, digital PCR (dPCR), kan utföra både detektion och absolut kvantifiering av nukleinsyramål utan behov av en standardkurva. dPCR har också förbättrats ytterligare från reaktionskammare som separeras av brunnarna i en vägg till emulsioner av olja, vatten och stabiliserande kemikalier inom samma brunn som ses i droppbaserad digital PCR2. I droplet digital PCR (ddPCR) delas ett prov upp i tusentals nanoliterstora droppar som innehåller individuella mål som senare kommer att kvantifieras med hjälp av Poisson-statistik 2,3,4. Denna teknik ger ddPCR en fördel när det gäller att kvantifiera låga rikliga mål jämfört med andra generationer av PCR.
Nyligen har flera applikationer belyst överlägsenheten hos ddPCR jämfört med den vanliga qPCR när man detekterar och kvantifierar låga rikliga mål 1,5,6. SARS-CoV-2 är inget undantag från dessa applikationer 7,8,9,10,11,12. Sedan utbrottet av SARS-CoV-2 har forskare arbetat på alla fronter för att komma fram till lösningar på hur man diagnostiserar viruset och upptäcker det effektivt. Den nuvarande guldstandarden är fortfarande qPCR13. RT-ddPCR har dock visat sig vara mer exakt när det gäller att upptäcka låga rikliga SARS-CoV-2-mål från både miljö- och kliniska prover jämfört med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De flesta av SARS-CoV-2 ddPCR-publicerade verk beror på simplexanalyser med multiplexa beroende på kommersiella analyser. Därför bör mer göras för att förklara hur man utvecklar multiplexa RT-dPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektion.
I en korrekt analysdesign kan multiplexering användas för att spara kostnader, öka provgenomströmningen och maximera antalet mål som kan detekteras känsligt i ett litet urval. Vid multiplexering med ddPCR måste man ta hänsyn till hur många fluoroforer som kan detekteras i ett visst system. Vissa ddPCR-plattformar kan stödja upp till tre kanaler medan andra bara stöder två kanaler. Därför, när multiplexering med två kanaler, måste man använda olika metoder, inklusive högre ordermultiplexering för att upptäcka mer än två mål14,15,16. I detta arbete används ett tvåfärgs ddPCR-detekteringssystem för att visa steg på hur man utvecklar olika SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan anpassas för olika forskningsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Få resurser finns tillgängliga för hur man utvecklar RT-ddPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektering. Även om de inte används i den här artikeln kan standardprover med kända kopior användas för att utveckla och optimera analyser. I detta arbete spikades dock SARS-CoV-2-prover odlade i Vero-E6-celler i en bakgrund av humant genomiskt RNA och användes som standardprover för att utveckla analyserna. Korrekta primer- och sondsekvenser är avgörande vid utveckling av analyser. Eftersom det mesta preliminära arbetet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Megaproject of Infectious Disease Control från Kinas hälsovårdsministerium, bidragsnummer 2017ZX10302301-005 och Sino-Africa Joint Research Center, bidragsnummer SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
Riferimenti
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
