Produktion af humane CRISPR-manipulerede CAR-T-celler
Summary
Her præsenterer vi en protokol til genredigering i primære menneskelige T-celler ved hjælp af CRISPR Cas Technology til at ændre CAR-T-celler.
Abstract
Adoptivcellebehandlinger ved hjælp af kimær antigenreceptor T-celler (CAR-T-celler) har vist bemærkelsesværdig klinisk effekt hos patienter med hæmatologiske maligniteter og er i øjeblikket ved at blive undersøgt for forskellige solide tumorer. CAR-T-celler genereres ved at fjerne T-celler fra en patients blod og konstruere dem til at udtrykke en syntetisk immunreceptor, der omdirigerer T-cellerne til at genkende og eliminere måltumorceller. Genredigering af CAR-T-celler har potentiale til at forbedre sikkerheden af de nuværende CAR-T-celleterapier og yderligere øge effekten af CAR-T-celler. Her beskriver vi metoder til aktivering, udvidelse og karakterisering af human CRISPR-konstruerede CD19-instruerede CAR-T-celler. Dette omfatter transduktion af CAR lentiviral vektor og brug af enkelt guide RNA (sgRNA) og Cas9 endonuclease til at målrette gener af interesse i T-celler. De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes universelt på andre CAR-konstruktioner og målrette gener ud over dem, der anvendes til denne undersøgelse. Desuden diskuterer denne protokol strategier for gRNA design, bly gRNA udvælgelse og mål gen knockout validering til reproducerativt opnå højeffektive, multiplex CRISPR-Cas9 engineering af kliniske grade menneskelige T-celler.
Introduction
Kimær antigen receptor (CAR)-T celleterapi har revolutioneret området for adoptivcellebehandlinger og kræft immunterapi. CAR-T-celler er manipuleret T-celler udtrykker en syntetisk immunreceptor, der kombinerer en antigen-specifik enkeltkæde antistof fragment med signalering domæner stammer fra TCRzeta kæde og costimulatory domæner nødvendige og tilstrækkelige til T-celle aktivering og co-stimulation1,2,3,4 . Fremstillingen af CAR-T-celler starter med at udtrække patientens egne T-celler, efterfulgt af ex vivo viral transduktion af CAR-modulet og udvidelse af CAR-T-celleproduktet med magnetiske perler, der fungerer som kunstigt antigen, der præsenterer cellerne5. Udvidede CAR-T-celler tilføres patienten igen, hvor de kan indpode, eliminere måltumorceller og endda fortsætte i flere år efter infusion6,7,8. Selvom CAR-T celleterapi har resulteret i bemærkelsesværdige responsrater i B-celle maligniteter, klinisk succes for faste tumorer er blevet udfordret af flere faktorer, herunder dårlig T-celle infiltration9, en immunosuppressiv tumor mikromiljø10, antigen dækning og specificitet, og CAR-T celle dysfunktion11,12 . En anden begrænsning af nuværende CAR-T celleterapi omfatter brugen af autologe T-celler. Efter flere runder af kemoterapi og høj tumor byrde, CAR-T celler kan være af dårlig kvalitet i forhold til allogene CAR-T produkter fra raske donorer ud over den tid og udgift, der er forbundet med fremstilling af autologe CAR-T celler. Genredigering af CAR-T-celleproduktet fra CRISPR/Cas9 repræsenterer en ny strategi for at overvinde de nuværende begrænsninger i CAR-T-cellerne13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 er et tokomponentsystem, der kan bruges til målrettet genomredigering ipattedyrcellerne 18,19. Crispr-associerede endonuclease Cas9 kan fremkalde stedspecifikke dobbeltstrengspauser styret af små RNA’er gennem baseparring med mål-DNA-sekvens20. I mangel af en reparation skabelon, er dobbelt-streng pauser repareret af den fejlbehæftede nonhomologous ende sammenføjning (NHEJ) vej, hvilket resulterer i frameshift mutationer eller for tidlig stop codons gennem indsættelse og sletning mutationer (INDELs)19,20,21. Effektivitet, brugervenlighed, omkostningseffektivitet og muligheden for multiplex-genomredigering gør CRISPR/Cas9 til et effektivt værktøj til at øge effektiviteten og sikkerheden af autologe og allogene CAR-T-celler. Denne fremgangsmåde kan også bruges til at redigere TCR-styrede T-celler ved at erstatte CAR-konstruktionen med en TCR. Derudover kan allogene CAR-T-celler, der har begrænset potentiale til at forårsage graft versus værtssygdom, også genereres ved genredigering af TCR, b2m og HLA locus.
I denne protokol viser vi, hvordan CRISPR-engineering af T-celler kan kombineres med viral vektormedieret levering af CAR-Transgene for at generere genom-redigerede CAR-T-celleprodukter med forbedret effektivitet og sikkerhed. Der vises et skemadiagram over hele processen i figur 1. Ved hjælp af denne tilgang har vi demonstreret højeffektiv gen knockout i primære menneskelige CAR-T-celler. Figur 2A beskriver i detaljer tidslinjen for hvert trin til redigering og fremstilling af T-celler. Strategier for guide RNA design og knockout validering er også drøftet for at anvende denne tilgang til forskellige mål gener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi tilgange til genredigering af CAR-T-celler ved hjælp af CRISPR Cas9-teknologi og fremstiller produkter til yderligere test for funktion og effektivitet. Ovenstående protokol er blevet optimeret til udførelse af CRIPSR genredigering i primære menneskelige T-celler kombineret med engineering T-celler med kimær antigen receptorer. Denne protokol giver mulighed for høj knockout effektivitet med minimal donor-til-donor variabilitet. Modifikation ved hjælp af CRISPR kan forbedre både effekten og sikker…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender Human Immunology Core for at levere normale donor T-celler og Flow Cytometry Core ved University of Pennsylvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Ricerca sul cancro. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
