Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.
Abstract
Le terapie cellulari adottive che utilizzano cellule T del recettore dell’antigene chimerico (cellule CAR-T) hanno dimostrato una notevole efficacia clinica in pazienti con neoplasie ematologiche e sono attualmente in fase di studio per vari tumori solidi. Le cellule CAR-T sono generate rimuovendo le cellule T dal sangue di un paziente e ingegnerizzandole per esprimere un recettore immunitario sintetico che reindirizza le cellule T per riconoscere ed eliminare le cellule tumorali bersaglio. L’editing genetico delle cellule CAR-T ha il potenziale per migliorare la sicurezza delle attuali terapie cellulari CAR-T e aumentare ulteriormente l’efficacia delle cellule CAR-T. Qui, descriviamo i metodi per l’attivazione, l’espansione e la caratterizzazione delle cellule CAR-T umane CD19 progettate con CRISPR. Ciò comprende la trasduzione del vettore lentivirale CAR e l’uso di RNA guida singolo (sgRNA) ed endonucleasi Cas9 per indirizzare i geni di interesse nelle cellule T. I metodi descritti in questo protocollo possono essere universalmente applicati ad altri costrutti CAR e geni bersaglio oltre a quelli utilizzati per questo studio. Inoltre, questo protocollo discute le strategie per la progettazione del gRNA, la selezione del gRNA principale e la convalida del knockout del gene bersaglio per ottenere in modo riproducibile l’ingegneria CRISPR-Cas9 multiplex ad alta efficienza delle cellule T umane di grado clinico.
Introduction
La terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico (CAR)-T ha rivoluzionato il campo delle terapie cellulari adottive e dell’immunoterapia del cancro. Le cellule CAR-T sono cellule T ingegnerizzate che esprimono un recettore immunitario sintetico che combina un frammento di anticorpo a catena singola antigene-specifico con domini di segnalazione derivati dalla catena TCRzeta e domini costimulatori necessari e sufficienti per l’attivazione e la co-stimolazione delle cellule T1,2,3,4 . La produzione di cellule CAR-T inizia estraendo le cellule T del paziente, seguita dalla trasduzione virale ex vivo del modulo CAR e dall’espansione del prodotto cellulare CAR-T con perle magnetiche che funzionano come antigene artificiale presentando cellule5. Le cellule CAR-T espanse vengono reinfuse nel paziente dove possono attecchire, eliminare le cellule tumorali bersaglio e persino persistere per più anni dopo l’infusione6,7,8. Sebbene la terapia con cellule CAR-T abbia portato a notevoli tassi di risposta nelle neoplasie delle cellule B, il successo clinico per i tumori solidi è stato messo alla prova da molteplici fattori tra cui la scarsa infiltrazione delle cellule T9,un microambiente tumorale immunosoppressivo10,la copertura e la specificità dell’antigene e la disfunzione delle cellule CAR-T11,12 . Un’altra limitazione dell’attuale terapia cellulare CAR-T include l’uso di cellule T autologhe. Dopo più cicli di chemioterapia e un elevato carico tumorale, le cellule CAR-T possono essere di scarsa qualità rispetto ai prodotti ALLOGENI CAR-T di donatori sani, oltre al tempo e alle spese associate alla produzione di cellule CAR-T autologhe. L’editing genetico del prodotto car-T di CRISPR/Cas9 rappresenta una nuova strategia per superare gli attuali limiti delle cellule CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 è un sistema bicomponente che può essere utilizzato per l’editing mirato del genoma nelle cellule di mammifero18,19. L’endonucleasi Associata a CRISPR Cas9 può indurre rotture a doppio filamento sito-specifiche guidate da piccoli RNA attraverso l’accoppiamento di basi con la sequenza di DNA bersaglio20. In assenza di un modello di riparazione, le rotture a doppio filamento vengono riparate dalla via NHEJ (nonhomologous end joining) soggetta a errori, con conseguenti mutazioni frameshift o codoni di arresto prematuro attraverso mutazioni di inserzione e delezione (INDL)19,20,21. Efficienza, facilità d’uso, economicità e capacità di editing del genoma multiplex rendono CRISPR/Cas9 un potente strumento per migliorare l’efficacia e la sicurezza delle cellule CAR-T autologhe e allogenei. Questo approccio può essere utilizzato anche per modificare le celle T dirette TCR sostituendo il costrutto CAR con un TCR. Inoltre, le cellule CAR-T allogeniche che hanno un potenziale limitato di causare la malattia del trapianto contro l’ospite possono anche essere generate dalla modifica genica del locus TCR, b2m e HLA.
In questo protocollo, mostriamo come l’ingegneria CRISPR delle cellule T può essere combinata con la consegna mediata da vettori virali del CAR-Transgene per generare prodotti a cellule CAR-T modificati dal genoma con maggiore efficacia e sicurezza. Un diagramma schematico dell’intero processo è mostrato nella Figura 1. Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato knockout genico ad alta efficienza nelle cellule CAR-T umane primarie. La Figura 2A descrive in dettaglio la sequenza temporale di ogni passaggio per la modifica e la produzione di celle T. Vengono inoltre discusse le strategie per la progettazione dell’RNA guida e la convalida del knockout per applicare questo approccio a vari geni bersaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo gli approcci per modificare le cellule CAR-T utilizzando la tecnologia CRISPR Cas9 e fabbricare prodotti per testare ulteriormente la funzione e l’efficacia. Il protocollo di cui sopra è stato ottimizzato per l’esecuzione dell’editing genetico CRIPSR in cellule T umane primarie combinate con cellule T ingegneristiche con recettori dell’antigene chimerico. Questo protocollo consente un’elevata efficienza di knockout con una variabilità minima da donatore a donatore. La modifica utilizzando CRISPR può mi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il Nucleo di Immunologia Umana per la fornitura di cellule T normali donatrici e il Nucleo di Citometria a Flusso presso l’Università della Pennsylvania.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
Riferimenti
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Ricerca sul cancro. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
